本文關(guān)鍵詞：中度嗜鹽菌Martelella sp.AD-3龍膽酸1，2-雙加氧酶的表達、純化及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是油田污染土壤中廣泛存在的“三致”化合物,油田PAHs的污染土壤通常具有高鹽,高pH和PAHs濃度高等特點,將非嗜鹽的PAHs高效降解菌引入到鹽堿環(huán)境中去除PAHs的效果往往不理想。針對鹽堿土壤PAHs污染生物修復(fù)效率較低的現(xiàn)狀,采用中度嗜鹽PAHs高效降解菌的生物降解方法日益受到關(guān)注,闡明中度嗜鹽菌降解PAHs的機理及關(guān)鍵降解酶的催化機制是應(yīng)用該菌實現(xiàn)生物強化修復(fù)的前提。本研究以鹽堿條件下能夠降解多種PAHs的中度嗜鹽菌Martelella sp.AD-3為研究對象,在基因組測序基礎(chǔ)上,利用特異性引物克隆了龍膽酸1,2-雙加氧酶(Gentisatel,2-dioxygenase, GDO)基因,并實現(xiàn)其在大腸桿菌E.coli21(DE3)中成功誘導(dǎo)表達,經(jīng)親和層析純化重組蛋白GDO,并對其進行了酶學(xué)性質(zhì)的分析；同時通過在高鹽度下以PAHs為唯一碳源和低鹽度下以甘油為唯一碳源的不同條件下培養(yǎng)AD-3菌,結(jié)合Label-Free技術(shù)分析不同培養(yǎng)條件下菌株中蛋白的差異表達；最后基于CRISPR-Cas9構(gòu)建菌株AD-3基因敲除體系,并利用該體系敲除GDO基因。主要結(jié)論如下：(1)以AD-3菌基因組DNA為模板,PCR擴增獲得1,077 bp的GDO基因,該基因在E.coli21(DE3)中成功表達,純化的GDO經(jīng)變性凝膠電泳和非變性凝膠電泳結(jié)果顯示大小分別約為38 kDa和120 kDa,該結(jié)果表明GDO為同源三聚體；GDO在pH 7.0,30℃,鹽度12%條件下具有最佳活性,該酶對龍膽酸的Km和kcat值分別是26.64μM和161.29 s-1；基于同位素標(biāo)記方法,首次發(fā)現(xiàn)GDO催化龍膽酸的兩個氧原子分別來自于H20和02的加氧機制；利用基因定點突變將GDO中高度保守的四個組氨酸分別突變?yōu)椴粩y帶電荷的賴氨酸,突變體蛋白全部失活,充分證明了四個組氨酸的重要性。(2)基于差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同培養(yǎng)條件下AD-3菌的蛋白表達差異,共識別出上調(diào)的蛋白187個,與PAHs降解相關(guān)蛋白16個,與嗜鹽相關(guān)的蛋白8個。結(jié)合AD-3菌全基因組序列和差異蛋白數(shù)據(jù),上調(diào)蛋白中與PAHs降解相關(guān)的關(guān)鍵酶-PAHs起始雙加氧酶的a和p亞基,表達量分別上調(diào)149.7倍和41倍；嗜鹽相關(guān)上調(diào)蛋白主要包括相容性溶質(zhì)甘氨酸甜菜堿合成關(guān)鍵蛋白上調(diào)19.1倍,以及甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運相關(guān)關(guān)鍵蛋白Transpotor ABC上調(diào)6.6倍。(3)基于CRISPR-Cas9構(gòu)建GDO基因的敲除質(zhì)粒pTC-gdo-3580,將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至AD-3菌中,用氨芐抗性篩選獲得轉(zhuǎn)化子,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)獲得突變菌株AD-3-pCT-gdo-3590。與野生型AD-3菌能夠利用龍膽酸為唯一碳源且觀察到明顯顏色變化相比,突變株未觀察到明顯生長和顏色變化,初步證明GDO基因敲除成功,該敲除體系為探索AD-3菌中為更多未知基因功能提供有力的工具。
【關(guān)鍵詞】：中度嗜鹽菌 微生物降解 GDO 差異蛋白質(zhì)組學(xué) CRISPR/Cas體系
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：X172
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第1章 緒論11-22
• 1.1 研究背景11
• 1.2 多環(huán)芳烴的微生物降解11-15
• 1.2.1 多環(huán)芳烴的微生物代謝途徑11-13
• 1.2.2 GDO研究進展13-15
• 1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)及其應(yīng)用15-17
• 1.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概念15-17
• 1.3.2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)概述17
• 1.4 Crispr/cas9基因敲除體系概述17-20
• 1.4.1 Crispr/cas9基因敲除體系的發(fā)現(xiàn)歷程18
• 1.4.2 Ⅱ型CRISPR/Cas功能行使機制18-20
• 1.5 研究目的及內(nèi)容20-22
• 1.5.1 研究目的20
• 1.5.2 研究內(nèi)容20-21
• 1.5.3 課題意義21
• 1.5.4 技術(shù)路線21-22
• 第2章 龍膽酸1,2-雙加氧酶的功能及性質(zhì)研究22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 實驗材料與方法22-27
• 2.2.1 實驗材料22-23
• 2.2.2 實驗方法23-27
• 2.3 結(jié)果與討論27-37
• 2.3.1 GDO基因的序列分析27-28
• 2.3.2 GDO表達質(zhì)粒的構(gòu)建28
• 2.3.3 GDO表達的優(yōu)化28-29
• 2.3.4 GDO蛋白的純化29-30
• 2.3.5 GDO酶學(xué)性質(zhì)研究30-33
• 2.3.6 GDO催化龍膽酸的機制研究33-34
• 2.3.7 龍膽酸氧化過程中的快速動力學(xué)研究34-35
• 2.3.8 基因定點突變實驗35-36
• 2.3.9 龍膽酸降解過程中g(shù)do轉(zhuǎn)錄水平研究36-37
• 2.4 本章小結(jié)37-38
• 第3章 中度嗜鹽菌AD-3差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究38-58
• 3.1 引言38
• 3.2 材料與方法38-41
• 3.2.1 實驗材料38
• 3.2.2 實驗方法38-41
• 3.3 結(jié)果與討論41-57
• 3.3.1 SDS電泳檢測蛋白表達量及主要上調(diào)蛋白鑒定41-43
• 3.3.2 差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析43-57
• 3.4 本章小結(jié)57-58
• 第4章 中度嗜鹽菌AD-3基因敲除體系構(gòu)建58-68
• 4.1 引言58
• 4.2 材料與方法58-61
• 4.2.1 實驗材料58-59
• 4.2.2 實驗方法59-61
• 4.3 結(jié)果與討論61-67
• 4.3.1 構(gòu)建敲除質(zhì)粒pTC61-65
• 4.3.2 敲除gdo65-67
• 4.4 本章小結(jié)67-68
• 第5章 結(jié)論與展望68-69
• 5.1 結(jié)論68
• 5.2 展望68-69
• 參考文獻69-80
• 致謝80-81
• 已發(fā)表論文81-82
• 附錄1：主要實驗儀器82-83
• 附錄2：主要實驗試劑83

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：中度嗜鹽菌Martelella sp.AD-3龍膽酸1，2-雙加氧酶的表達、純化及功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：269086