【摘要】：氯代乙酰胺類除草劑因分子結(jié)構(gòu)中具有酰胺基團(tuán)(CONH-)而得名,因其高效、高選擇性而在全球范圍內(nèi)廣泛使用。乙草胺[2’-乙基-6’-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代-N-乙酰苯胺]是氯代乙酰胺類除草劑的重要代表,主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。乙草胺的主要生物降解產(chǎn)物為2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)和2-甲基-6-乙基苯胺(MEA),研究表明殘留在環(huán)境中的乙草胺及其降解中間產(chǎn)物對(duì)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)都具有一定的危害。本實(shí)驗(yàn)室以乙草胺為靶標(biāo),篩選到一株能將乙草胺轉(zhuǎn)化為CMEPA的菌株Rhodococcus sp. T3-1和一株能將CMEPA水解為MEA的菌株Delftia sp. T3-6.本文以Rhodococcus sp. T3-1為材料,對(duì)乙草胺N-脫乙氧甲基酶(簡稱N-脫烷基酶)基因進(jìn)行克隆,以Delftia sp. T3-6為材料,對(duì)CMEPA水解酶基因進(jìn)行克隆,并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究�？焖儆行У拿富顪y(cè)定方法是蛋白質(zhì)純化的前提,本論文首先建立了一種快速測(cè)定CMEPA水解產(chǎn)物MEA的方法。在20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,10-50μM的2,6-甲乙基苯胺在鐵氰化鉀催化下與4-氨基安替比林反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì),該物質(zhì)在535 nm的吸光值與MEA濃度有良好的線性關(guān)系,底物CMEPA、 SDS、甲醇等有機(jī)試劑、1 mM的金屬離子對(duì)顯色反應(yīng)無顯著影響。溫度和pH對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著。該方法也適用于其它苯胺苯酚類衍生物的測(cè)定。通過硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Butyl-650M疏水層析和Superdex G-200凝膠層析4步純化流程,獲得達(dá)電泳純的目的蛋白(DamH).純化倍數(shù)為17.7倍,蛋白回收率為0.29%。肽指紋分析得到兩條肽段APEADDELRR和TNPLANPLKASYQGFPR, N端測(cè)序15個(gè)氨基酸序列為Gly-Thr-Ser-Pro-Gln-Ser-Asp-Phe-Leu-Arg-Ala-Leu-Phe-Gln-Ser.根據(jù)N端氨基酸序列及肽指紋圖譜設(shè)計(jì)引物,利用染色體步移技術(shù)克隆到Ilelftia sp. T3-6 CMEPA水解酶編碼基因damH,該基因全長903 bp,編碼300個(gè)氨基酸,分子量為32 kDa,與來源于Acinetobacter sp. SE19的環(huán)已醇降解基因簇的ChnC一致性為67%。構(gòu)建表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)-(pET-29a(+)-JamH),經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,實(shí)現(xiàn)重組酶DamH在E. coli BL21(DE3)中的異源表達(dá)。DamH是一個(gè)具有酯類水解活性的酰胺水解酶,在以CMEPA為底物時(shí)比活力為5036 U/mg,在以4-硝基苯酯為底物時(shí)比活力為612U/mg。DamH最適底物為CMEPA,其Km和kcat值分別為0.197 mM和2804.32 s-1。DamH具有催化芳基酰胺類化合物水解和對(duì)硝基苯酯類、三酰甘油酯和ε-已內(nèi)酯水解的能力,最適酶反應(yīng)pH為6.5,最適酶反應(yīng)溫度為35℃。Mn2+離子對(duì)酶活有促進(jìn)作用,Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe2+對(duì)酶活有抑制作用；PMSF、SDS強(qiáng)烈抑制酶的活性,而EDTA和DMSO對(duì)酶活影響較小。定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DamH活性中心可能由S149-E244-H274三聯(lián)體結(jié)構(gòu)組成,除活性中心構(gòu)成外,三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果也顯示DamH與酯酶3FAK類似,具有一個(gè)典型的Gly-X-Ser-X-Gly保守序列和S149,E244,H274三聯(lián)體催化中心以及HGX結(jié)構(gòu)(79HGG81)。DamH在蛋白濃度為15 mg/mL,結(jié)晶池母液為：0.2 M乙酸銨,pH7.1,21%PEG 3350,坐滴氣相擴(kuò)散法20℃下約18天能長出衍射能力達(dá)3.4 A的晶體。乙草胺的降解首先要進(jìn)行N-脫乙氧甲基,生成CMEPA進(jìn)而被DamH水解為MEA。該過程由乙草胺N-脫烷基酶催化完成,乙草胺N-脫烷基酶性質(zhì)非常不穩(wěn)定,普通的超聲波破碎法會(huì)導(dǎo)致酶快速失活。本論文首先研究了細(xì)胞破碎提取乙草胺N-脫烷基酶粗酶液的方法和測(cè)活體系,建立了以液氮研磨方法制備Rhodococcus sp. T3-1粗酶液的方法,在含1 mM NADH+H+,40%蔗糖,0.1 M NaCl,10mM MgCl2,2mMβ-巰基乙醇的20 mM Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液中,利用粗酶液和DamH兩步催化形成MEA,利用顯色法可間接檢測(cè)到乙草胺N-脫烷基酶活性。通過硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析從Rhodococcus sp. T3-1粗酶液中分離到三個(gè)蛋白,肽指紋圖譜結(jié)果顯示三個(gè)蛋白分別為鐵氧化還原酶EthA (45 kDa)、鐵氧還蛋白EthD(11kDa)和細(xì)胞色素P450單加氧酶EthB (43 kDa)。基于氨基酸序列分析和核酸序列分析,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ethABCD基因簇,分別構(gòu)建不同基因組織形式的表達(dá)菌株,以誘導(dǎo)表達(dá)菌株全細(xì)胞進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了參與乙草胺N-脫乙氧甲基反應(yīng)的三個(gè)蛋白為EthA-EthD-EthB。
【圖文】：

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質(zhì)晶體學(xué)的發(fā)展使從原子水平上認(rèn)識(shí)酶的反應(yīng)機(jī)制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結(jié)構(gòu)（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個(gè)氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結(jié)合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑

２．２．２芳基憸胺酶和憸胺酶的特征逡逑蛋白質(zhì)晶體學(xué)的發(fā)展使從原子水平上認(rèn)識(shí)酶的反應(yīng)機(jī)制成為可能，Ａｋａｓｈｉ邋Ｏｈ化ｋｉ逡逑等解析了來源于巧々0加ｃｏｃｃｗ邋ｓｐ．邋Ｎ－７７１的ＲｈＡｍｉｄａｓｅ邋（ＰＤＢ：邋３Ａ１Ｋ）的結(jié)構(gòu)（圖１－９）。逡逑ＲｈＡｍｉｄａｓｅ能水解己憸胺、丙憸胺、苯甲櫼胺，其活性中也由Ｓｅｒｌ７１，Ｓｅｒｌ９５和Ｌｙｓ９６逡逑Ｈ個(gè)氨基酸殘基組成（圖１－１０），其中Ｓｅｒｌ７１位于一段憸胺酶家族高度保守的序列逡逑（Ｇ１６９－Ｇ１７０－Ｓ１７１－Ｓ１７２－Ｇ１７３－Ｇ１７４）之中［９５］。逡逑圖１－９邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ結(jié)構(gòu)示意圖逡逑巧ｇ．邋１－９邋Ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑ＰｈｅｌｉＳｓ／逡逑^6逡逑＾邐Ｓｅｒ１７１逡逑Ａｌａ１９５邋巧邋ｅｒ１９邋巧、邐、逡逑Ｌｙｓ９６邋／逡逑圖１－１０邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ的活性中屯及與底物結(jié)合方式逡逑Ｆｉｇ．邋１－１０邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉ化邋ｏｆ邋ＲｈＡｍｉｄａｓｅ逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：X592;X172

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本文編號(hào)：2606536