本文選題：透明質(zhì)酸　切入點(diǎn)：測(cè)定方法　出處：《江南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡(jiǎn)稱HA)是一種重要的醫(yī)藥材料和化妝品原料,并被列為新資源食品。近年來(lái),微生物發(fā)酵法已經(jīng)逐步取代了動(dòng)物組織提取法,成為制備HA的主要方法。 在發(fā)酵法制備HA的過(guò)程中,需要對(duì)大量發(fā)酵液樣品進(jìn)行HA含量的測(cè)定。傳統(tǒng)的Bitter-Miur法測(cè)定步驟繁瑣,以濃硫酸-咔唑溶液為反應(yīng)試劑,具有一定危險(xiǎn)性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,簡(jiǎn)稱CTAB)與HA反應(yīng)產(chǎn)生混濁的特性,建立了CTAB比濁法:配制25 mg/ml的CTAB試液,選擇400 nm作為CTAB比濁法的吸收波長(zhǎng),在室溫下,將純化后的樣液與CTAB試液準(zhǔn)確反應(yīng)10 min,各樣品的測(cè)定時(shí)間誤差控制在10 s以內(nèi),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出待測(cè)樣中HA含量。試驗(yàn)表明,CTAB比濁法的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度均高于Bitter-Muir法。除了蛋白質(zhì)外,其它雜質(zhì)對(duì)CTAB比濁法影響較小。該法安全性高,操作簡(jiǎn)便快捷,適合對(duì)大量發(fā)酵液樣品進(jìn)行測(cè)定,適用于測(cè)定HA的分子量范圍為≥50 000 Da。 本研究以馬疫鏈球菌(Streptococcus equisimilis)為出發(fā)菌,通過(guò)紫外線和60CO-γ射線輻照相結(jié)合的方法對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變選育,篩選出無(wú)溶血性、HA產(chǎn)量和分子量均較高的突變株NC168,其HA產(chǎn)量為150.61 mg/L,分子量為677 000 Da。突變株經(jīng)過(guò)多次傳代,HA產(chǎn)量和HA分子量保持穩(wěn)定,溶血性無(wú)回復(fù)突變現(xiàn)象,為進(jìn)一步研究發(fā)酵法生產(chǎn)HA打下了基礎(chǔ)。針對(duì)突變株NC168,通過(guò)單因素試驗(yàn)和二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,并建立了回歸模型: Y=174.76168+6.09122X3-9.26943X12-12.92694X22-14.36237X32-12.20569X42由此得到了最佳培養(yǎng)基:酵母膏30 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖5 g/L和MgSO4·7H2O 1.5 g/L,模型預(yù)測(cè)HA產(chǎn)量為174.76 mg/L,驗(yàn)證試驗(yàn)HA產(chǎn)量達(dá)到178.53 mg/L,模型能較好的預(yù)測(cè)HA產(chǎn)量。將此培養(yǎng)基應(yīng)用于5 L發(fā)酵罐,進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)。研究表明:pH值,初糖濃度,溫度和攪拌速度對(duì)HA產(chǎn)量均有顯著影響。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:pH值為7.0,初糖濃度為30 g/L,溫度35℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵HA的產(chǎn)量可達(dá)3.0 g/L。在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上,以Logistic,Slogistic和SGompertz三種模型對(duì)菌體生長(zhǎng)過(guò)程中生物量和HA產(chǎn)量進(jìn)行非線性擬合,結(jié)果表明,生物量模型以Logistic模型擬合效果最佳,擬合方程為: y = 2 .933?1 +(x/21.18.41985)4.453,相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.999;而在HA合成擬合中,以Slogistic模型最佳,擬合方程為:y =(?),相關(guān)系數(shù)R2為0.996;在對(duì)基質(zhì)(葡萄糖)的消耗擬合中,采用DoseResp模型,擬合方程為: y =(?),相關(guān)系數(shù)R2為0.991。 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀與超濾相結(jié)合的方法對(duì)HA進(jìn)行分離純化。將發(fā)酵液稀釋到HA含量為0.6-0.8 g/L,加入發(fā)酵液體積15%的CTAB溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%),在35℃下沉淀1 h,將沉淀置于濃度為1.5 mol/L的NaCl溶液中解離4 h,選擇濃度為70%乙醇進(jìn)行沉淀。經(jīng)上述處理后HA得率可達(dá)93.8%,HA中蛋白含量可降至1.5%。選擇截留分子量為100 KDa的超濾膜對(duì)經(jīng)過(guò)季銨鹽沉淀得到的HA進(jìn)行超濾,樣液濃度為0.02%-0.05%,過(guò)膜壓力為11 psi,HA得率可達(dá)到93.5%,蛋白去除率達(dá)到94.0%。經(jīng)分離純化后,HA總得率為87.7%,HA中蛋白含量可降至0.09%,葡萄糖醛酸含量可達(dá)43.5%,達(dá)到醫(yī)藥級(jí)水平。 為了獲得性能良好的HA水凝膠,選擇分子量為1 500 000 Da的HA與海藻酸鈉(sodium alginate,簡(jiǎn)稱SAL)進(jìn)行復(fù)合改性。以醋酸鹽緩沖液作為調(diào)節(jié)pH的試劑,碳化二亞胺(EDC)作為羧基激活劑,已二酰肼(ADH)作為交聯(lián)劑,制備了HA-SAL復(fù)合水凝膠。通過(guò)紅外光譜驗(yàn)證了HA與SAL之間形成的酰胺鍵,通過(guò)電鏡觀察了所形成凝膠的微結(jié)構(gòu)。質(zhì)構(gòu)特征分析表明,凝膠的硬度隨著兩種多糖濃度升高而增加,隨著HA/SAL摩爾比例升高而減小。凝膠的溶脹率與HA的比例成正相關(guān),而與EDC用量成負(fù)相關(guān)。隨著SAL比例和EDC用量的增加,所形成凝膠的抗透明質(zhì)酸酶降解能力得到提高。所制備的HA-SAL水凝膠具有較高的溶脹率、理化穩(wěn)定性、天然的生物相容性和一定的生物降解性,具有應(yīng)用于真皮填充物、組織工程支架材料等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在用途。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：TQ920.1

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳輝;于剛;高瑞昌;吳燕燕;戚勃;馬海霞;陳勝軍;;水生生物來(lái)源透明質(zhì)酸的生化特性及其制備的研究進(jìn)展[J];食品工業(yè)科技;2013年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 鄧開野;生物體透明質(zhì)酸的仿生制取[D];吉林大學(xué);2004年

，

本文編號(hào)：1616584