本文關鍵詞：CARM1對胚胎造血以及胸腺細胞發(fā)育的調節(jié)

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【摘要】：前言 造血干細胞的自我更新以及全能分化的能力持續(xù)終身。表觀遺傳修飾能夠促進細胞分化。因為細胞分化前后的遺傳信息不同,DNA甲基化和組蛋白甲基化等表觀修飾對于細胞分化保持在某一狀態(tài)必不可少。表觀遺傳機制如同鉸鏈般控制定向分化,但是一般來說對去分化卻不起這樣的作用。一些小分子表觀遺傳調節(jié)蛋白,以及一些特殊基因的過表達,可以作為影響細胞分化的可塑性元件。當這些因素被逆轉,會導致細胞進入iPS (induced pluripotent stem)全能分化狀態(tài)。由此,造血干細胞的分化過程可能是研究表觀遺傳改變的最好的生物學系統(tǒng)。近期研究對DNA的甲基化模式的研究表明在造血過程中每一個時期,每個亞群細胞定向中存在其特殊的甲基化形式。同DNA甲基化一樣,大量相關研究表明精氨酸甲基化在淋巴細胞分化和信號轉導中作用同樣重要。作為一種常見的轉錄后修飾,精氨酸的甲基化往往改變其底物的生物學作用,其機理如下：1)為含Tudor結構的效應因子(effectot molecules)提供了錨docking site[7.8.9.10];2)阻斷蛋白-蛋白相互作用,如某些SH3結構介導的相互作用；3)對AKT介導的磷酸化的負調節(jié)作用,因為AKT序列含有氨基酸殘基；4)阻斷賴氨酸甲基化。 在胞漿和胞核中都有蛋白質精氨酸甲基化酶(arginine methyltransfe-rases, PRMTs)的底物存在,組蛋白是胞核中的一種非常重要的底物。PRMTs催化的組蛋白甲基化是轉變細胞命運的表觀遺傳密碼的主要成因。哺乳動物PRMT酶家族有九個成員,分別是PRMT1-9。大多數(shù)成員都作用于組蛋白H3的N端,組蛋白4(H4),以及組蛋白2A(H2A)。 CARM1/PRMT4是這個家族中第一個被發(fā)現(xiàn)有轉錄輔激活因子功能的成員,其作用于H4R17, H3R26,以及其他轉錄調節(jié)因子。前期研究表明CARM1Knock out小鼠胚胎比野生型小,出生后無法正常呼吸,即刻死亡。對于該動物模型的研究已經表明若干表型的存在,大部分與細胞分化相關。CARM1Knock out出生致死性與肺泡Ⅱ型上皮細胞過多導致肺泡Ⅰ型上皮細胞發(fā)育不全有關。由此,CARM1在正常肺泡細胞分化中有重要作用。CARM1Knock out小鼠缺乏棕色脂肪,相關研究發(fā)現(xiàn)CARM1null細胞不能分化成脂細胞。CARM1在軟骨發(fā)生以及骨骼肌發(fā)育中作用相當重要,對于維持正常胚胎T細胞數(shù)量及分化有重要作用。綜上,CARM1活性在多個器官包括肺,脂肪,肌肉,軟骨以及胸腺細胞中有不可或缺的作用。本課題將進一步探索CARM1Knock out小鼠模型的免疫系統(tǒng)表型,CARM1在胸腺細胞發(fā)育中的作用,及其產生的機制。 第一部分敲除CARM1基因對小鼠淋巴細胞發(fā)育的影響 目的 觀察敲除CARM1基因對小鼠胸腺細胞發(fā)育造成的影響。 方法 通過同系繁殖(CARAi+/-小鼠,培育CARM1-/-胚胎；Southern Blot及PCR驗證小鼠基因型；通過細胞計數(shù)及流式細胞分析技術,根據(jù)細胞表面標志物不同,區(qū)分不同亞群,獲得各個亞群的信息,分析胸腺細胞。 結果 驗證小鼠體內CARM1基因被成功敲除；CARM1基因敲除鼠身長顯著小于野生型,僅為對照的60%大��；CARM1基因敲除鼠的胸腺亦顯著小于對照；CARM1-胸腺細胞數(shù)顯著少于對照；CARM1-/-胸腺中,DN1細胞數(shù)量與對照相近,但DN2,DN3,DN4均減少90%,CD4SP,CD8SP減少75%,y δ T細胞數(shù)量顯著減少85%。 小結 驗證小鼠體內CARM1基因確被敲除；驗證胚胎表型,包括胚胎長度為對照60%,胸腺發(fā)育不全,存在DN1-DN2發(fā)育阻滯。 第二部分CAR1-/-小鼠胚胎中胸腺細胞發(fā)育缺陷與胸腺上皮細胞的關系 目的 鑒于胸腺細胞發(fā)育與胸腺上皮細胞(TEC)聯(lián)系密切,探討CARM1-/-小鼠胸腺發(fā)育不全是否有胸腺上皮細胞中缺乏CARM1引起。 方法 培育CARM1-/-胚胎,免疫熒光化學及流式細胞術檢測E18.5胸腺上皮細胞各組分的分布；構建腎包膜下同種異體胸腺移植模型,分別將去除胸腺細胞的胸腺上皮組織,植入先天性無胸腺卻有來自骨髓的正常胸腺前T細胞的受體裸鼠體內,6-8周后處死小鼠,流式細胞術檢測胸腺細胞各個組分是否重建。 結果 免疫應光化學顯示：E12.5,E13.5胸腺K5/K8染色中,CARM1-/-胸腺明顯小于同齡對照,但其皮質髓質分布形式未見異常；E18.5流式細胞術顯示CARM1-/-胸腺其內皮質細胞(MHCII+Ly51+)及髓質細胞(MHCII+UEA+)的絕對數(shù)量與對照接近,未見異常；及成功構建腎下囊同種異體胸腺移植模型后胸腺細胞得以重建,雖然CARM1-/-數(shù)量較對照稍少,但其比例未見異常。 小結 雖然CARM1-/--胸腺小于對照,但是其皮髓質分布正常；據(jù)流式細胞術,其皮質和髓質細胞絕對數(shù)量未見減少；腎下囊同種異體胸腺移植動物模型的建立后相關分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細胞能夠支持正常前T細胞的發(fā)育,因此CARM1-/-小鼠的胸腺上皮細胞數(shù)量及功能未見異常,即CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細胞引起。 第三部分CARM1造血過程中的影響 目的 觀察CARM1基因敲除后對小鼠胚胎造血過程的影響,追溯其胸腺細胞數(shù)目減少最早發(fā)生時間,探討CARM1-/-胸腺發(fā)育細胞發(fā)育阻滯,數(shù)量減少的原因,是否由其上游干細胞的缺陷引起。 方法 培育CARM1-/-還胎,免疫熒光化學及流式細胞術檢測不同胎齡CARMl-/-胸腺中早期造血祖細胞的數(shù)量；競爭性重建實驗：Actin-GFP小鼠與CARM1+/-雜交獲得GFP+CARMl+/小鼠后,同系繁殖獲得GFP+CARM-/-胚胎,混合相同數(shù)量的GFP+CARMl-/-與GFP-CARMl+/-胸腺細胞,眼眶后靜脈注射至受體鼠,6-8周后處死受體小鼠,流式細胞術分析其胸腺,外周淋巴細胞各組分是否有效重建。 結果 1.CARM1-/-E12.5CD45+造血祖細胞數(shù)目顯著減少,cKit+CD25+染色,顯示早期胸腺細胞減少改變延續(xù)E13.5乃至E17.5,持續(xù)整個胚胎期； 2. CARM1-/-骨髓細胞總數(shù)顯著減少,KLS亞群的比例和絕對細胞數(shù)顯著減少；F1k2+MPP減少了95%,LT-HSC和ST-HSC分別減少大約80%；下游的定向分化祖細胞也受波及,1ineage1℃D27+Flk2+亞群亞群數(shù)量減少93％.CD27+F1k2+亞群減少85%, CMP和MEP明顯減少分別達92%和66%,GMP未受影響； 3.與骨髓相反,E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細胞數(shù)與對照接近,無顯著差異；CARM1-/-LT-HSC的數(shù)量略為升高,進而總KLS細胞量略高。其他所有造血祖細胞數(shù)量沒有顯著差異。 4. E14.5GFP+CARM1-/-胚胎肝臟細胞整體細胞數(shù)目未見顯著減少,且KLS亞群的比例及比例及絕對數(shù)量未見差異； 5.競爭性重建實驗表明,與Calm+/+干細胞相比,Carml-/-重建的DN1至CD4SP或CD8SP各個亞群均大幅度減少。在同樣的競爭條件下,Carml-/-干細胞分化產生的各亞群細胞,MEP除外,遠少于Carm1+/+干細胞。 小結 CARM1-/-骨髓細胞LT-HSC及其引起的CLP減少,印證E18.5CARM1-/-觀察到的胸腺細胞和脾B細胞的減少。由此,CARM1對于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺,但是未受影響的GMP亞群反應CARM1缺失并不影響遲些的髓系分化。E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細胞數(shù)未見異常,LT-HSC及KLS細胞量略高,其他造血祖細胞數(shù)量未見差異,提示CARM1對于維持胚胎肝臟中造血祖細胞的數(shù)量并非必要。競爭性重建實驗反映Carm1-/-干細胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細胞。雖然在E14.5CARM1-/-胚胎肝臟中存在與對照無顯著差異數(shù)量的造血干細胞,但其造血能力因CARM1基因敲除嚴重受損。鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內微環(huán)境CARM1并未敲除,造血干細胞中內源性CARM1在造血過程中必不可少。 結論 1.驗證小鼠體內CARM1基因確被敲除；驗證胚胎表型包括胚胎長度為對照60%,胸腺發(fā)育不全,存在DN1-DN2發(fā)育阻滯. 2. CARMl-/-胸腺皮髓質分布正常；絕對數(shù)量未見減少；腎下囊同種異體胸腺移植動物模型的建立后相關分析顯示CARM1-/-胸腺上皮細胞能夠支持正常前T細胞的發(fā)育,CARM1-/-小鼠胚胎中胸腺細胞發(fā)育缺陷并非由胸腺上皮細胞引起。 3.CARM1-/-骨髓細胞LT-HSC及其引起的CLP減少,與E18.5CARM1-/-觀察到的胸腺細胞和脾B細胞的減少呼應。CARM1對于造血早期以及隨后的淋巴分化不可或缺,但是未受影響的GMP亞群反應CARM1缺失并不影響髓系分化。 4.E18.5CARM1-/-胚胎肝臟的總細胞數(shù)未見異常,LT-HSCs及KLS細胞量略高,其他造血祖細胞數(shù)量未見差異,提示CARM1對于維持胚胎肝臟中造血祖細胞的數(shù)量并非必要。 5.競爭性重建實驗結果反映同等條件下,Carm1-/-干細胞造血能力顯著弱于Carm+/+干細胞,E14.5CARM1-/-胚胎肝臟造血干細胞的造血能力因CARM1基因敲除嚴重受損。 6.鑒于受體RAG2-/-γc-/-鼠體內微環(huán)境CARM1并未敲除,造血干細胞中內源性CARM1在造血過程中必不可少。
【關鍵詞】：CARM1 胸腺細胞 胸腺上皮細胞(TEC) 造血干細胞(HSC) 腎下囊同種異體移植 競爭性重建實驗
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：D919.1
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-15
• 英文縮略語注釋15-16
• 前言16-19
• 第一部分 敲除CARM1基因對小鼠淋巴細胞發(fā)育的影響19-36
• 前言19-22
• 材料與方法22-30
• 結果30-35
• 小結35-36
• 第二部分 CARM1~(-/-)小鼠胚胎中胸腺細胞發(fā)育缺陷與胸腺上皮細胞的關系36-53
• 前言36-39
• 材料與方法39-47
• 結果47-52
• 小結52-53
• 第三部分 CARM1在造血過程中的影響53-73
• 前言53-56
• 材料與方法56-65
• 結果65-72
• 小結72-73
• 討論73-75
• 結論75-76
• 參考文獻76-86
• 附錄86-87
• 致謝87-88

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Thymic epithelial progenitor cells and thymus regeneration: an update[J];Cell Research;2007年01期

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本文編號：593798