本文關鍵詞：24個Y-STR基因座熒光標記復合檢測體系的建立及其法醫(yī)學應用

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【摘要】：人類Y染色體屬于性染色體,為正常男性所特有,除擬常染區(qū)(pseudoautosomal region, PAR)外,在遺傳過程中不發(fā)生重組,其序列結構除突變外由父代不變的傳遞給子代,同一父系人群的Y染色體在理論上相同。Y染色體的這一特性,使其在法醫(yī)DNA檢驗和親權鑒定方面有巨大應用潛力。同時由于其具有男性特異性,在實際辦案中,對性侵犯、傷害等案件中提取到的男女混合檢材進行鑒定時,Y染色體遺傳標記檢驗技術更有其特殊的價值,能夠獲得男性個體Y染色體遺傳信息同時不受女性成分影響。鑒于以上特點,Y染色體長期以來都是作為重要的研究檢驗對象被應用于法醫(yī)物證檢驗。 針對Y染色體第二代遺傳標記——短串聯(lián)重復序列(STR, short tandem repeats)而進行的熒光標記復合擴增檢驗,是目前應用最廣泛、技術最成熟的Y染色體遺傳信息檢驗技術,具有操作簡單、檢測信息通量高、結果數(shù)字化顯示易于存儲比對等優(yōu)點。基于這一技術而開發(fā)的各種商業(yè)化試劑盒,已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗鑒定中得到廣泛應用。2003年Promega公司推出的PowerPlexTM Y試劑盒在一個反應管中同時擴增12個Y-STRs基因座,其中包括ISFH (International Society of Forensic Haemogenetics)認定的歐洲MHL(最小單倍型,minimal haplotypes loci)的9個基因座及SWGDAM (美國DNA分析方法科學工作組,Scientific Working Group On DNA Analysis Methods)推薦的11個基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM試劑盒,可以實現(xiàn)同步擴增檢測17個Y-STR基因座。但這些現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒主要是按照歐洲人群統(tǒng)計選擇的基因座位點,其中不少基因座的多態(tài)性在中國人群中比較低,如DYS391在中國人群中多態(tài)性小于0.4,加之基因座數(shù)量少,造成了系統(tǒng)整體個體識別能力低,在法醫(yī)鑒定的實際應用中有時會遇到瓶頸,特別是近年隨著DNA數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,比對樣本基數(shù)的增加,Y-STR作為家系排查的主要比對指標,現(xiàn)有Y-STR檢測系統(tǒng)識別率不足的缺點日益突出,影響了其數(shù)據(jù)庫比對效能,出現(xiàn)了如嫌犯與多個不同家系的Y-STR單倍型匹配,造成無法排查的情況,或者由于Y-STR突變,造成家系比對無法確定或誤判的情況。 因此,開發(fā)一種針對中國人群的多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡單和能同時檢測更多基因座的Y-STR檢測體系,成為我國法醫(yī)物證檢驗鑒定的迫切需要。本文根據(jù)過去十幾年國內外針對中國人群Y-STR的研究,選擇針對中國男性的GD(基因多態(tài)性,gene diversity)數(shù)值較高的Y-STR基因座,建立了24個Y-STR基因座熒光標記復合擴增檢測體系,有效提高Y-STR檢測體系對中國人群的鑒別能力和效率,解決了現(xiàn)有Y-STR熒光檢驗試劑盒識別能力不足的難題。 本文通過查閱文獻,從中選取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、 DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、 DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS444等未在現(xiàn)有商業(yè)試劑盒體系內、在中國人群中基因多態(tài)性高(GD0.6)、且等位基因跨度較小的基因座21個,考慮到需要與現(xiàn)有商業(yè)試劑盒聯(lián)用,特地加入DYS635和DYS385a/b三個基因座,同時應用目前最先進的5色熒光標記,將24個基因座分成四組,使用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標記,分子量內標用第五色熒光染料SIZ(橙色熒光,無錫中德美聯(lián)公司)標記,組成24個Y-STR基因座復合擴增體系。隨后通過先對24個基因座的單一擴增條件進行優(yōu)化,在成功地建立了單個基因座擴增條件的基礎上,研究24個基因座復合擴增PCR反應條件,通過實驗確定了復合擴增體系的循環(huán)參數(shù)、緩沖液離子強度、酶量、復合擴增反應體積以及熒光標記引物濃度等,使擴增產(chǎn)物達到平衡、特異的要求,建立穩(wěn)定、均衡的復合擴增體系,實現(xiàn)同時擴增24個Y-STR基因座。 本文通過編制GeneMapper ID3.2分析文件panel、bins,使用混合單基因座擴增產(chǎn)物方法制作等位基因標準物ladder,使用5色熒光Matrix與SIZ-500內標,建立了基于ABI基因分析儀的自動毛細管電泳檢驗方法。PCR擴增產(chǎn)物使用3130XL型遺傳分析儀進行電泳檢測,用軟件Foundation data collection收集原始掃描數(shù)據(jù),GeneMapper ID3.2進行Y-STR基因分型。對24個Y-STR復合擴增體系的男性特異性、家系穩(wěn)定性、種屬特異性、靈敏度、人體細胞同一性等法醫(yī)學應用相關指標進行了實驗研究,進一步驗證了該體系特異性好、性能穩(wěn)定、反應靈敏。 本文應用建立的24個Y-STR復合擴增檢測系統(tǒng),對146份廣東地區(qū)無關男性個體進行檢測,同時應用AmpFISTR YfilerTM試劑盒進行比較檢測,得到Y-STR分型數(shù)據(jù)后,用直接計數(shù)法計算各等位基因頻率。基因多態(tài)性(gene diversity, GD)及單倍型多樣性(haplotype diversity, HD),按公式h=n(1-∑Pi2)/(n-1)計算(n為樣本例數(shù),Pi為等位基因頻率)。并計算累積的GD值(TGD,相當于常染色體STR評估指標中的累積非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)計算(GDn為各基因座的GD值)。24個Y-STR復合擴增體系共得到145種單倍型,其中144種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,單位點GD值為0.55(DYS531)-0.96(DYS385a/b)HD值為0.99972,TGD值為1-1.88E-14; YfilerTM系統(tǒng)的共得到143種單倍型,其中141種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,1種單倍型出現(xiàn)3次,單位點GD值為0.36(DYS389)-0.96(DYS385a/b), HD值為0.99858,TGD值為1-4.97E-9；24個Y-STR復合擴增體系與YfilerTM系統(tǒng)聯(lián)用的共得到145種單倍型,其中144種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,HD值為0.99972,TGD值為1-1.066E-20。 研究表明,本文建立的24個Y-STR復合擴增體系穩(wěn)定、高效、操作簡單易用,特異性強,可滿足日常法醫(yī)物證Y-STR檢驗需要,具有良好的中國人群針對性,系統(tǒng)識別率高于目前最常用的商業(yè)AmpFISTR YfilerTM試劑盒,能夠很好的解決目前Y-STR商業(yè)試劑盒信息量少、個體識別率低的不足。本系統(tǒng)作為Y-STR檢驗補充手段,應用熒光標記毛細管電泳技術,可應用于目前國內絕大多數(shù)法醫(yī)物證實驗室,在法醫(yī)物證案件檢驗、親權鑒定與Y-STR數(shù)據(jù)庫建設具有廣泛的應用前景。
【關鍵詞】：Y染色體 短串聯(lián)重復序列 DYS635DYS385a/b DYS531DYS630DYS622DYS552DYS510DYS449DYS459a/b DYS446DYS443DYS587DYS527a/b DYS460Y-GATA-A10DYS520DYS557DYS522DYS481DYS570DYS444熒光 復合擴增 法醫(yī)學
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 第一章 Y-STR復合擴增體系基因座選擇與系統(tǒng)設計18-25
• 1.1 技術路線18-19
• 1.2 位點選擇19-21
• 1.3 引物設計和合成21-23
• 1.4 Matrix制作23-25
• 第二章 24個Y-STR復合擴增檢測體系的建立25-45
• 一、材料與方法25-30
• 二、結果與分析30-41
• 三、討論41-45
• 第三章 24個Y-STR復合擴增體系的評價與法醫(yī)學參數(shù)統(tǒng)計45-59
• 一、材料與方法45-50
• 二、結果50-54
• 三、討論54-55
• 四、應用案例55-59
• 附表59-83
• 全文小結83-85
• 參考文獻85-90
• 英文縮略語對照表90-91
• 攻讀學位期間成果91-92
• 致謝92-94
• 統(tǒng)計學證明94

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬沁雅;山西漢族Y-STR基因座DYS510和DYS542遺傳多態(tài)性及法醫(yī)學應用[D];山西醫(yī)科大學;2010年

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本文編號：542214