本文關(guān)鍵詞：24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合檢測體系的建立及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

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【摘要】：人類Y染色體屬于性染色體,為正常男性所特有,除擬常染區(qū)(pseudoautosomal region, PAR)外,在遺傳過程中不發(fā)生重組,其序列結(jié)構(gòu)除突變外由父代不變的傳遞給子代,同一父系人群的Y染色體在理論上相同。Y染色體的這一特性,使其在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)和親權(quán)鑒定方面有巨大應(yīng)用潛力。同時(shí)由于其具有男性特異性,在實(shí)際辦案中,對性侵犯、傷害等案件中提取到的男女混合檢材進(jìn)行鑒定時(shí),Y染色體遺傳標(biāo)記檢驗(yàn)技術(shù)更有其特殊的價(jià)值,能夠獲得男性個(gè)體Y染色體遺傳信息同時(shí)不受女性成分影響。鑒于以上特點(diǎn),Y染色體長期以來都是作為重要的研究檢驗(yàn)對象被應(yīng)用于法醫(yī)物證檢驗(yàn)。 針對Y染色體第二代遺傳標(biāo)記——短串聯(lián)重復(fù)序列(STR, short tandem repeats)而進(jìn)行的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn),是目前應(yīng)用最廣泛、技術(shù)最成熟的Y染色體遺傳信息檢驗(yàn)技術(shù),具有操作簡單、檢測信息通量高、結(jié)果數(shù)字化顯示易于存儲比對等優(yōu)點(diǎn)�；谶@一技術(shù)而開發(fā)的各種商業(yè)化試劑盒,已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)鑒定中得到廣泛應(yīng)用。2003年P(guān)romega公司推出的PowerPlexTM Y試劑盒在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增12個(gè)Y-STRs基因座,其中包括ISFH (International Society of Forensic Haemogenetics)認(rèn)定的歐洲MHL(最小單倍型,minimal haplotypes loci)的9個(gè)基因座及SWGDAM (美國DNA分析方法科學(xué)工作組,Scientific Working Group On DNA Analysis Methods)推薦的11個(gè)基因座。2004年由ABI公司推出的AmpFISTR Y filerTM試劑盒,可以實(shí)現(xiàn)同步擴(kuò)增檢測17個(gè)Y-STR基因座。但這些現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒主要是按照歐洲人群統(tǒng)計(jì)選擇的基因座位點(diǎn),其中不少基因座的多態(tài)性在中國人群中比較低,如DYS391在中國人群中多態(tài)性小于0.4,加之基因座數(shù)量少,造成了系統(tǒng)整體個(gè)體識別能力低,在法醫(yī)鑒定的實(shí)際應(yīng)用中有時(shí)會遇到瓶頸,特別是近年隨著DNA數(shù)據(jù)庫的發(fā)展,比對樣本基數(shù)的增加,Y-STR作為家系排查的主要比對指標(biāo),現(xiàn)有Y-STR檢測系統(tǒng)識別率不足的缺點(diǎn)日益突出,影響了其數(shù)據(jù)庫比對效能,出現(xiàn)了如嫌犯與多個(gè)不同家系的Y-STR單倍型匹配,造成無法排查的情況,或者由于Y-STR突變,造成家系比對無法確定或誤判的情況。 因此,開發(fā)一種針對中國人群的多態(tài)性高、性能穩(wěn)定、操作簡單和能同時(shí)檢測更多基因座的Y-STR檢測體系,成為我國法醫(yī)物證檢驗(yàn)鑒定的迫切需要。本文根據(jù)過去十幾年國內(nèi)外針對中國人群Y-STR的研究,選擇針對中國男性的GD(基因多態(tài)性,gene diversity)數(shù)值較高的Y-STR基因座,建立了24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢測體系,有效提高Y-STR檢測體系對中國人群的鑒別能力和效率,解決了現(xiàn)有Y-STR熒光檢驗(yàn)試劑盒識別能力不足的難題。 本文通過查閱文獻(xiàn),從中選取DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、 DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS587、DYS527a/b、 DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、 DYS444等未在現(xiàn)有商業(yè)試劑盒體系內(nèi)、在中國人群中基因多態(tài)性高(GD0.6)、且等位基因跨度較小的基因座21個(gè),考慮到需要與現(xiàn)有商業(yè)試劑盒聯(lián)用,特地加入DYS635和DYS385a/b三個(gè)基因座,同時(shí)應(yīng)用目前最先進(jìn)的5色熒光標(biāo)記,將24個(gè)基因座分成四組,使用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標(biāo)記,分子量內(nèi)標(biāo)用第五色熒光染料SIZ(橙色熒光,無錫中德美聯(lián)公司)標(biāo)記,組成24個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增體系。隨后通過先對24個(gè)基因座的單一擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,在成功地建立了單個(gè)基因座擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上,研究24個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件,通過實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)合擴(kuò)增體系的循環(huán)參數(shù)、緩沖液離子強(qiáng)度、酶量、復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體積以及熒光標(biāo)記引物濃度等,使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平衡、特異的要求,建立穩(wěn)定、均衡的復(fù)合擴(kuò)增體系,實(shí)現(xiàn)同時(shí)擴(kuò)增24個(gè)Y-STR基因座。 本文通過編制GeneMapper ID3.2分析文件panel、bins,使用混合單基因座擴(kuò)增產(chǎn)物方法制作等位基因標(biāo)準(zhǔn)物ladder,使用5色熒光Matrix與SIZ-500內(nèi)標(biāo),建立了基于ABI基因分析儀的自動毛細(xì)管電泳檢驗(yàn)方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用3130XL型遺傳分析儀進(jìn)行電泳檢測,用軟件Foundation data collection收集原始掃描數(shù)據(jù),GeneMapper ID3.2進(jìn)行Y-STR基因分型。對24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系的男性特異性、家系穩(wěn)定性、種屬特異性、靈敏度、人體細(xì)胞同一性等法醫(yī)學(xué)應(yīng)用相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,進(jìn)一步驗(yàn)證了該體系特異性好、性能穩(wěn)定、反應(yīng)靈敏。 本文應(yīng)用建立的24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增檢測系統(tǒng),對146份廣東地區(qū)無關(guān)男性個(gè)體進(jìn)行檢測,同時(shí)應(yīng)用AmpFISTR YfilerTM試劑盒進(jìn)行比較檢測,得到Y(jié)-STR分型數(shù)據(jù)后,用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因頻率。基因多態(tài)性(gene diversity, GD)及單倍型多樣性(haplotype diversity, HD),按公式h=n(1-∑Pi2)/(n-1)計(jì)算(n為樣本例數(shù),Pi為等位基因頻率)。并計(jì)算累積的GD值(TGD,相當(dāng)于常染色體STR評估指標(biāo)中的累積非父排除率CPE)按公式TGD=1-(1-GD1)(1-GD2)(1-GD3)(1-GD4)...(1-GDn)計(jì)算(GDn為各基因座的GD值)。24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系共得到145種單倍型,其中144種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,單位點(diǎn)GD值為0.55(DYS531)-0.96(DYS385a/b)HD值為0.99972,TGD值為1-1.88E-14; YfilerTM系統(tǒng)的共得到143種單倍型,其中141種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,1種單倍型出現(xiàn)3次,單位點(diǎn)GD值為0.36(DYS389)-0.96(DYS385a/b), HD值為0.99858,TGD值為1-4.97E-9；24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系與YfilerTM系統(tǒng)聯(lián)用的共得到145種單倍型,其中144種單倍型出現(xiàn)1次,1種單倍型出現(xiàn)2次,HD值為0.99972,TGD值為1-1.066E-20。 研究表明,本文建立的24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系穩(wěn)定、高效、操作簡單易用,特異性強(qiáng),可滿足日常法醫(yī)物證Y-STR檢驗(yàn)需要,具有良好的中國人群針對性,系統(tǒng)識別率高于目前最常用的商業(yè)AmpFISTR YfilerTM試劑盒,能夠很好的解決目前Y-STR商業(yè)試劑盒信息量少、個(gè)體識別率低的不足。本系統(tǒng)作為Y-STR檢驗(yàn)補(bǔ)充手段,應(yīng)用熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù),可應(yīng)用于目前國內(nèi)絕大多數(shù)法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室,在法醫(yī)物證案件檢驗(yàn)、親權(quán)鑒定與Y-STR數(shù)據(jù)庫建設(shè)具有廣泛的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：Y染色體 短串聯(lián)重復(fù)序列 DYS635DYS385a/b DYS531DYS630DYS622DYS552DYS510DYS449DYS459a/b DYS446DYS443DYS587DYS527a/b DYS460Y-GATA-A10DYS520DYS557DYS522DYS481DYS570DYS444熒光 復(fù)合擴(kuò)增 法醫(yī)學(xué)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 第一章 Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系基因座選擇與系統(tǒng)設(shè)計(jì)18-25
• 1.1 技術(shù)路線18-19
• 1.2 位點(diǎn)選擇19-21
• 1.3 引物設(shè)計(jì)和合成21-23
• 1.4 Matrix制作23-25
• 第二章 24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增檢測體系的建立25-45
• 一、材料與方法25-30
• 二、結(jié)果與分析30-41
• 三、討論41-45
• 第三章 24個(gè)Y-STR復(fù)合擴(kuò)增體系的評價(jià)與法醫(yī)學(xué)參數(shù)統(tǒng)計(jì)45-59
• 一、材料與方法45-50
• 二、結(jié)果50-54
• 三、討論54-55
• 四、應(yīng)用案例55-59
• 附表59-83
• 全文小結(jié)83-85
• 參考文獻(xiàn)85-90
• 英文縮略語對照表90-91
• 攻讀學(xué)位期間成果91-92
• 致謝92-94
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明94

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：542214