【摘要】： 目的:內(nèi)毒素休克是嚴(yán)重危害人類健康的病理過(guò)程,死亡率極高,一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)課題。血管調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂是內(nèi)毒素休克特征性病理改變之一,主要表現(xiàn)為內(nèi)毒素休克發(fā)生早期主動(dòng)脈壓下降、肺動(dòng)脈壓升高。在內(nèi)毒素休的發(fā)病過(guò)程中氧自由基(oxygen-derived free radicals,OFR)的生成增多與血管調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂密切相關(guān),是造成內(nèi)毒素休克患者持續(xù)性低血壓的重要原因之一。其中超氧陰離子(superoxide anion, )能衍生多種其他氧化劑、啟動(dòng)過(guò)氧化損傷,還可以與同時(shí)增多的一氧化氮(nitric oxide,NO)通過(guò)快速非酶促化學(xué)反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)。ONOO-的反應(yīng)性極強(qiáng),可與機(jī)體絕大多數(shù)成分反應(yīng),可劑量依賴性導(dǎo)致離體胸主動(dòng)脈收縮反應(yīng)進(jìn)行性低下,表明由NO和衍生的ONOO-可能是內(nèi)毒素休克發(fā)病過(guò)程中引起動(dòng)脈反應(yīng)性異常變化的關(guān)鍵因素。 八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是一種小分子腦腸肽,通過(guò)其受體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,其受體屬于G蛋白藕聯(lián)受體,根據(jù)親和力以及生物學(xué)功能的不同,分為A、B兩種亞型。CCK-8具有明確的抗內(nèi)毒素休克作用,其詳細(xì)分子作用機(jī)制尚不十分清楚。CCK-8可抑制內(nèi)毒素孵育的培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生成ONOO-,而對(duì)外源性O(shè)NOO-沒(méi)有直接清除作用,表明CCK-8作用的靶分子可能是血管一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)或的生成體系。本室已有研究表明CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(thoracic aortic smooth muscle cells,TASMCs)SOD活性變化有調(diào)節(jié)作用,本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上觀察CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的影響,進(jìn)一步研究CCK-8緩解內(nèi)毒素休克血管動(dòng)力學(xué)紊亂的分子機(jī)制。 方法:選用雄性、健康Wistar大鼠(120±20g),無(wú)菌條件下分離大鼠胸主動(dòng)脈,用貼塊法培養(yǎng)TASMCs,傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(實(shí)驗(yàn)用5～8代),調(diào)整細(xì)胞密度為每瓶1×107,加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液以及不同處理因素,分組如下:1、LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá):以生理鹽水為對(duì)照組,用0.1mg/L LPS孵育細(xì)胞2h、4h和8h,0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L LPS分別孵育細(xì)胞4h,測(cè)定CuZn-SOD mRNA表達(dá)變化。2、CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的影響:以生理鹽水為對(duì)照組,經(jīng)10-8mol/L CCK-8,0.1mg/L LPS和10-6、10-8、10-10mol/L CCK-8+LPS分別孵育細(xì)胞4h,測(cè)定CuZn-SOD mRNA表達(dá)變化。3、CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)影響的受體機(jī)制:以生理鹽水為對(duì)照組,10-8mol/L CCK-8、0.1mg/L LPS、CCK-8+LPS和10-5mol/L CR-1409+CCK-8+LPS、10-5mol/L CR-2945+CCK-8+LPS分別分別孵育細(xì)胞4h,測(cè)定CuZn-SOD mRNA表達(dá)變化,其中CR-1409、CR-2945分別為CCK-AR和CCK-BR特異性拮抗劑。 用RT-PCR方法檢測(cè)CuZn-SOD基因表達(dá),用江蘇捷達(dá)凝膠分析軟件對(duì)電泳譜帶進(jìn)行半定量分析,用CuZn-SOD與β-actin的吸光度比值代表CuZn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)水平。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結(jié)果:1、LPS對(duì)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的影響(1)LPS與CuZn-SOD基因表達(dá)的時(shí)效關(guān)系對(duì)照組TASMCs存在CuZn-SOD mRNA低水平表達(dá);0.1mg/L LPS孵育細(xì)胞2h CuZn-SOD mRNA表達(dá)呈現(xiàn)增高趨勢(shì),LPS孵育細(xì)胞4h CuZn-SOD mRNA表達(dá)增高與對(duì)照組相比有明顯差異(P0.01),LPS孵育細(xì)胞8h CuZn-SOD mRNA持續(xù)高表達(dá)(P0.05)。(2)LPS與CuZn-SOD基因表達(dá)的量效關(guān)系對(duì)照組TASMCs存在CuZn-SOD mRNA低水平表達(dá);0.01 mg/L、0.1 mg/L及1mg/L LPS孵育細(xì)胞4h CuZn-SOD mRNA表達(dá)均增高,0.1mg/L LPS組與對(duì)照組相比有明顯差異(P0.01),1mg/L LPS組CuZn-SOD mRNA持續(xù)高表達(dá)(P0.05)。 2、CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的影響CCK-8預(yù)先處理TASMCs 30 min后再加入LPS,則LPS對(duì)TASMCs CuZn-SOD mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用可部分受抑,且此抑制效應(yīng)呈劑量依賴性,與LPS組相比有顯著性差異(P0.01);CCK-8單獨(dú)孵育也可抑制CuZn-SOD mRNA表達(dá),與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.01)。 3、CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)影響的受體機(jī)制預(yù)先用CR-1409、CR-2945處理TASMCs 10 min后,再分別加入LPS和CCK-8。CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS兩組CuZn- SOD mRNA表達(dá)均高于CCK-8+LPS組(P0.01),但仍低于LPS組(P0.05),其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409稍明顯。 結(jié)論:在生理狀態(tài)下TASMCs CuZn-SOD基因有基礎(chǔ)表達(dá);LPS可誘導(dǎo)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)增加;CCK-8可抑制TASMCs CuZn-SOD基因基礎(chǔ)表達(dá),下調(diào)LPS對(duì)TASMCs CuZn-SOD基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用,CCK-8通過(guò)其受體發(fā)揮上述調(diào)節(jié)作用,其中CCK-BR較CCK-AR作用稍大。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2582584