【摘要】： 前言 曲馬多(tramadol)化學(xué)名為(±)-2-(二甲氨甲基)-1-(間-甲氧苯基)-環(huán)已醇,是20世紀(jì)70年代末由原西德研究開發(fā)的中樞作用鎮(zhèn)痛藥。通過作用于阿片受體和抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的再攝取兩方面機制鎮(zhèn)痛。與阿片類藥物比較,曲馬多具有呼吸抑制作用輕,成癮性小等特點,被主要用于中、重度急、慢性疼痛的治療。由于曲馬多的廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)也日漸出現(xiàn)。國際上對曲馬多上市后的不良反應(yīng)和濫用監(jiān)測表明,正常醫(yī)療目的使用情況下,曲馬多濫用病例(相對于曲馬多使用人群)的發(fā)生率很低。曲馬多在臨床上廣泛使用和作為其它毒品的替代品是發(fā)生其濫用的主要原因。20世紀(jì)90年代末曲馬多濫用問題基本得到控制,但近年來曲馬多濫用又在我國許多地區(qū)開始流行,據(jù)媒體報道,在廣東、吉林和北京等地區(qū)都出現(xiàn)了曲馬多濫用成癮的病例,造成不良社會影響。 藥物依賴是神經(jīng)系統(tǒng)對反復(fù)使用成癮藥物后產(chǎn)生的適應(yīng)性變化,是一類復(fù)雜的精神疾病,主要包括精神依賴性和軀體依賴性。精神依賴性是指藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用后所產(chǎn)生的一種特殊的獎賞效應(yīng),表現(xiàn)為心理渴求和持續(xù)強迫覓藥行為。軀體依賴性是指藥物依賴后一旦停藥或使用藥物受體拮抗劑,將發(fā)生一系列生理功能紊亂,并出現(xiàn)戒斷綜合癥。研究認(rèn)為,藥物依賴的持續(xù)狀態(tài)在于成癮性藥物誘導(dǎo)了長期的神經(jīng)適應(yīng)性變化,尤其是轉(zhuǎn)錄過程的改變以及轉(zhuǎn)錄因子參與的基因表達(dá)在其中發(fā)揮了重要的作用。額葉皮質(zhì)牽涉到高級認(rèn)知功能和動機功能,依賴患者都存在認(rèn)知功能的損害,說明額葉皮質(zhì)是藥物成癮重要的腦區(qū)之一。 目前環(huán)腺苷酸反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element binding protein,CREB)是在藥物濫用研究機制探討較多的轉(zhuǎn)錄因子,嗎啡、可卡因等阿片類藥物發(fā)生依賴和戒斷時,CREB在額葉皮質(zhì)中表達(dá)增加,但海馬及紋狀體未發(fā)生改變。CREB在不同腦區(qū)表達(dá)量的不同與阿片受體的分布和腦組織的差異有關(guān)。CREB是首先被發(fā)現(xiàn)與藥物依賴密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,是腦內(nèi)介導(dǎo)多個信號通路調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的主要細(xì)胞核因子,為多種受體后信號通路的歸結(jié)點,是藥物依賴形成長期記憶的分子開關(guān)。許多藥物依賴的發(fā)生都與cAMP-蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)-磷酸化環(huán)腺苷酸反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(phophorylated cAMP-responsive element bindingprotein,pCREB)通路激活有關(guān)。 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)特有的標(biāo)志物。生理情況下腦內(nèi)少有表達(dá),在病理情況下出現(xiàn)反應(yīng)性表達(dá)上調(diào),腦損傷及其他藥物誘導(dǎo)細(xì)胞變性、增生、肥大。GFAP的高表達(dá)表明AS的活化,也增強了清除興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和離子,包括谷氨酸(glutamic acid,Glu)、H~+、K~+及自由基等的能力,且貯存糖原、合成細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子增多,有利于重建神經(jīng)元的完整性,修復(fù)神經(jīng)功能。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測鹽酸曲馬多依賴大鼠額葉皮質(zhì)pCREB和GFAP表達(dá)情況。目前國內(nèi)外尚無有關(guān)鹽酸曲馬多藥物依賴pCREB和GFAP的變化情況的研究。 實驗方法 30日齡健康、雄性Wistar大鼠30只,體重100±10g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。動物飼養(yǎng)溫度維持在18-26℃,光暗周期為12小時。實驗前在上述條件下喂養(yǎng)5天,以適應(yīng)環(huán)境。動物實驗過程中遵循實驗動物使用倫理手冊相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。將30只大鼠隨機分為對照組、依賴組及戒斷組。依賴組每日以鹽酸曲馬多60mg/kg灌胃給藥,共115天。戒斷組每日以60mg/kg灌胃給藥,于第113日給予生理鹽水戒斷。對照組每目給予生理鹽水灌胃,共115天。給藥期間,大鼠分籠飼養(yǎng),自由攝取食物和水,每日觀察各實驗組大鼠行為表現(xiàn)并稱重。末次灌胃后2小時立即以過量3%戊巴比妥鈉麻醉處死,取額葉皮質(zhì),4%多聚甲醛溶液/0.01mol/LPBS(pH7.4)固定48小時,經(jīng)水洗,脫水,透明,石蠟包埋,制作5gm連續(xù)切片。留取部分額葉皮質(zhì)組織用冷生理鹽水清洗后加蛋白裂解液勻漿,用于Western blot檢測。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和Western blot檢測曲馬多依賴大鼠額葉皮質(zhì)中pCREB和GFAP表達(dá)情況,以對照組作對照,顯微鏡×400倍下,隨機選取10個視野,計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)(個/視野)和陽性細(xì)胞灰度值。以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker作指示,在PVDF膜上陽性表達(dá)顯示為藍(lán)色譜帶,藍(lán)色譜帶的濃淡和大小表示蛋白表達(dá)的強弱。應(yīng)用FluochemV2.0軟件測各片段的平均光密度值,測得數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。用SPSS11.0 for Windows進(jìn)行單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果 一、曲馬多依賴和戒斷大鼠行為學(xué)變化 與對照組大鼠相比較,依賴組大鼠自給藥后一周開始出現(xiàn)對聲音及觸摸刺激反應(yīng)性增高,出現(xiàn)奔跑、跳躍、豎尾(照片2)、頭部側(cè)偏、輕度共濟失調(diào)以及原地轉(zhuǎn)圈行走等現(xiàn)象,上述癥狀可于給藥后即出現(xiàn),多持續(xù)1至2小時后逐漸消失。戒斷組大鼠于停藥36-48h逐漸出現(xiàn)明顯的戒斷癥狀:煩躁不安、高度激惹、蹦跳、尖叫、異常姿勢(照片3)、叩齒、咬牙、濕狗樣顫抖、甩頭、上瞼下垂、腹瀉、清理皮毛、站立等,體重增長速度也明顯下降。戒斷24-36h最為明顯。以后逐漸減弱,72h后戒斷癥狀基本消失。 二、曲馬多依賴和戒斷大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變 1、腦宏觀檢查 未見異常改變。 2、HE染色 額葉皮質(zhì)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙增寬,可見膠質(zhì)細(xì)胞增生和膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成。 三、曲馬多依賴和戒斷大鼠體重的變化 1、依賴大鼠體重的變化 與對照組相比較,依賴組大鼠自給藥后第1-3周體重平均增加28g,對照組大鼠體重平均增加23g,增加速度高于對照組。第4周以后依賴組大鼠體重增加明顯比對照組緩慢。利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS采用NPar Tests中的Wilcoxon Signed Ranks Test分析方法,P＜0.01,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。藥物依賴大鼠體重的增長速度明顯低于對照組大鼠體重增長的速度。 2、戒斷大鼠體重的變化 各組在停藥后至處死前體重變化情況:對照組體重仍呈上升趨勢,平均體重由380g增長到401g,增長了19g;依賴組平均體重由223g增長到232g,增長了9g;戒斷組平均體重由226g降低到212g,體重減少了14g。利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS采用單因素方差分析,P＜0.01,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。戒斷組大鼠體重增長速度明顯低于對照組和依賴組大鼠體重增長速度。 四、pCREB和GFAP免疫組織化學(xué)染色 對照組大鼠pCREB陽性染色主要表達(dá)在神經(jīng)元胞核中,少數(shù)膠質(zhì)細(xì)胞胞核也呈陽性表達(dá),血管內(nèi)皮細(xì)胞未見陽性表達(dá)。經(jīng)陽性細(xì)胞計數(shù),對照組大鼠額葉皮質(zhì)pCREB陽性細(xì)胞數(shù)為40.9±1.89個/視野,依賴組78.5±3.79個/視野,戒斷組130.5±2.53個/視野,依賴組和戒斷組pCREB陽性細(xì)胞數(shù)均增多,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組大鼠額葉皮質(zhì)pCREB陽性細(xì)胞灰度值為70.87±4.85,依賴組43.02±3.12,戒斷組34.09±3.53,依賴組和戒斷組pCREB陽性細(xì)胞灰度值均減少,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組GFAP陽性染色主要表達(dá)在AS胞質(zhì)及突起中。經(jīng)陽性細(xì)胞計數(shù),對照組大鼠額葉皮質(zhì)陽性細(xì)胞數(shù)12.56±6.43個/視野,依賴組22.23±9.34個/視野,戒斷組34.91±8.36個/視野,依賴組和戒斷組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均增多,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組大鼠額葉皮質(zhì)陽性細(xì)胞灰度值為65.87±3.21,依賴組40.09±3.56,戒斷組30.02±3.11,依賴組和戒斷組GFAP陽性細(xì)胞灰度值均減少,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。 五、Western blot檢測 平均光密度檢測,對照組大鼠額葉皮質(zhì)pCREB平均光密度為40.26±3.01,依賴組60.36±2.14,戒斷組105.24±2.04,依賴組和戒斷組pCREB平均光密度增多,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組大鼠額葉皮質(zhì)GFAP平均光密度為12.22±3.29,依賴組22.34±2.04,戒斷組34.61±3.01,依賴組和戒斷組GFAP平均光密度增多,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。 討論 本研究中,依賴組和戒斷組大鼠額葉皮質(zhì)pCREB蛋白表達(dá)與對照組比較明顯增加,變化有統(tǒng)計學(xué)意義。曲馬多使大鼠額葉皮質(zhì)中pCREB蛋白表達(dá)發(fā)生改變。提示pCREB參與曲馬多精神依賴及軀體依賴中的形成。pCREB與增強神經(jīng)元的存活與保護機制有關(guān),pCREB是藥物依賴過程中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一,是多種受體后信號通路的歸結(jié)點,pCREB促使許多基因的表達(dá)發(fā)生了改變,影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起神經(jīng)元細(xì)胞核功能的改變,從而導(dǎo)致部分靶基因的轉(zhuǎn)錄速率發(fā)生變化,繼而改變了神經(jīng)元的活動,最終會使這些神經(jīng)元相互作用的環(huán)路發(fā)生改變,結(jié)果表現(xiàn)為動物行為持久的改變。 本研究還發(fā)現(xiàn),依賴組和戒斷組大鼠額葉皮質(zhì)中GFAP蛋白表達(dá)與對照組比較明顯增加,變化有統(tǒng)計學(xué)意義。GFAP蛋白表達(dá)量的增加表明AS的增生和發(fā)育,是AS對神經(jīng)元損傷的適應(yīng)性改變,在曲馬多依賴及戒斷時GFAP蛋白表達(dá)增多,有利于增加AS骨架的穩(wěn)定性,AS的激活有利于滿足其代謝活動的增加,減輕藥物對神經(jīng)元的損傷,本研究表明AS在曲馬多藥物依賴和戒斷后可能具有保護作用。 結(jié)論 1、曲馬多(60mg/kg)慢性給藥引起實驗大鼠依賴癥狀,戒斷組大鼠出現(xiàn)戒斷癥狀。本實驗研究成功復(fù)制了曲馬多依賴與戒斷的大鼠動物模型。 2、依賴和戒斷大鼠額葉皮質(zhì)區(qū)pCREB表達(dá)增加,提示大鼠額葉皮質(zhì)是產(chǎn)生曲馬多藥物依賴的主要部位之一,并可能通過pCREB而產(chǎn)生。 3、大鼠曲馬多依賴及戒斷后額葉皮質(zhì)GFAP表達(dá)增多,有利于增加AS骨架的穩(wěn)定性,AS的激活有利于滿足其代謝活動的增加,減輕曲馬多對神經(jīng)元的損傷,提示AS在曲馬多藥物依賴和戒斷后可能具有保護作用。
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【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2454503