【摘要】： 背景:死亡時間(postmortem interval,PMI)或稱死后經(jīng)過時間(time since death,TSD)即發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔,PMI推斷是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最為重要的研究課題之一。但由于影響PMI推斷的因素很多,單一方法的準(zhǔn)確性往往不能令人滿意,多因素、多指標(biāo)的綜合研究,即人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network,ANN)的研究成為趨勢。隨著分子生物學(xué)和計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,通過檢測mRNA降解推斷PMI成為可能。本研究應(yīng)用一步法熒光標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測了大鼠死后不同時間間隔腦、肝、脾、腎管家基因磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)及β-肌動蛋白(β-actin)mRNA的降解情況,旨在為PMI推斷提供一種新的指標(biāo)。 目的:通過系統(tǒng)觀察大鼠死后不同時間腦、肝、脾、腎管家基因GAPDH及β-actin mRNA的降解規(guī)律,確定大鼠死后不同組織GAPDH及β-actin mRNA的檢測時限,探討其在PMI推斷上的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值,為PMI推斷的研究提供一種新的、可靠的檢測指標(biāo)。 方法:Wistar大鼠56只,雌雄不限,體重200～250g,斷頸處死后置于20℃溫度控制系統(tǒng)內(nèi)。分別于死后0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、72h、4d、5d、6d、7d、8d、9d解剖(n=4),按照RNA抽提的方法,分別提取大鼠腦、肝、脾、腎的總RNA,利用ABI 9700型PCR基因擴(kuò)增儀,通過一步法復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增,各時間點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物分別在ABI 3100型DNA遺傳分析儀上進(jìn)行電泳分離,并應(yīng)用其自帶的分析軟件(GeneScan Analysis Version 3.1),通過與Genescan-500TM ROX(marker)標(biāo)準(zhǔn)分子量作比對,確定腦、肝、脾、腎管家基因GAPDH及β-actin mRNA轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物,記錄并分析每個特異性峰的峰面積(Peak Area),各時間點(diǎn)與死后即時(0h)的峰面積之比值作為該點(diǎn)mRNA的相對含量。以未加RT/Platinum? Taq混合酶的作為實(shí)驗陰性對照組。 結(jié)果:大鼠死后7d腦組織、48h肝組織、32h脾組織、40h腎組織內(nèi)均可檢測到GAPDH mRNA,8d腦組織、72h肝組織、40h脾組織、48h腎組織內(nèi)均可檢測到β-actin mRNA,且其量均呈規(guī)律性下降趨勢(電泳峰面積逐漸變小、譜帶亮度逐漸變暗并最終消失),其擴(kuò)增產(chǎn)物的降解過程呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。應(yīng)用EXCEL 2003及SPSS 11.5對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理及線性回歸分析,發(fā)現(xiàn)大鼠死后不同時間腦、肝、脾、腎GAPDH及β-actin mRNA的相對含量均與PMI高度相關(guān)(P0.01),并得出相應(yīng)的回歸方程: 1.大鼠PMI(x,d)與腦mRNA含量(y)的回歸方程: GAPDH:y=-0.122x+0.923,R2=0.973 (x≤7d)β-actin: y=-0.104x+0.925,R2=0.973 (x≤8d) 2.大鼠PMI(x,h)與肝mRNA含量(y)的回歸方程: GAPDH:y=-0.019x+0.989,R2=0.968 (x≤48h)β-actin: y=-0.013x+0.945,R2=0.890 (x≤72h) 3.大鼠PMI(x,h)與脾mRNA含量(y)的回歸方程: GAPDH:y=-0.025x+1.054,R2=0.969 (x≤32h)β-actin: y=-0.023x+1.021,R2=0.993 (x≤40h) 4.大鼠PMI(x,h)與腎mRNA含量(y)的回歸方程: GAPDH:y=-0.022x+1.049,R2=0.978 (x≤40h)β-actin: y=-0.018x+0.975,R2=0.991 (x≤48h) 結(jié)論:本實(shí)驗可得出以下結(jié)論: 1.大鼠死后管家基因GAPDH、β-actin mRNA具有一定的穩(wěn)定性。 2.大鼠死后不同組織、不同管家基因mRNA的穩(wěn)定性(即檢測時限)不同:對于GAPDH,腦為7d,肝為48h,脾為32h,腎為40h;對于β-actin,腦為8d,肝為72h,脾為40h,腎為48h;與GAPDH mRNA相比,β-actin mRNA更不易降解。 3.一步法熒光標(biāo)記RT-PCR技術(shù)檢測大鼠死后不同組織(腦、肝、脾、腎)管家基因GAPDH及β-actin mRNA的降解規(guī)律,可為PMI推斷的研究提供一種新的、客觀、有效的觀測指標(biāo),可為常規(guī)PMI推斷方法的補(bǔ)充。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：D919

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2446392