本文選題：SELDI-TOF + MS�。� 參考：《四川大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 第一部分SELDI-TOF MS篩選大鼠急性心肌缺血早期標(biāo)記物的研究 背景冠心病在我國的發(fā)病率逐年上升，病死率和致殘率居高不下，也是構(gòu)成法醫(yī)學(xué)猝死的主要原因。冠心病病人約有1／4無明顯的胸痛等癥狀，約50％無心電圖改變。法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)：如果心肌缺血發(fā)生在室間隔等重要部位，即使是微小的心肌梗死，也會(huì)引起心源性猝死。臨床上常用肌鈣蛋白等作冠心病的輔助診斷，但該蛋白是確診心肌梗死的指標(biāo)，在血漿中要2-4 h以后才出現(xiàn)，更早的心肌缺血指標(biāo)如C反應(yīng)蛋白，心肌脂肪酸結(jié)合蛋白等特異性較差，需要和肌鈣蛋白聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)方法繁復(fù)。因此，尋找新的特異性好的心肌缺血的早期標(biāo)志物顯得尤為重要。 SELDI-TOF MS是近年來新的蛋白質(zhì)組分析工具，其原理是：用不同性質(zhì)的化學(xué)芯片結(jié)合不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)和多肽，經(jīng)過能量分子結(jié)合后受激光的激發(fā)進(jìn)入質(zhì)譜，以其在質(zhì)譜中的不同飛行時(shí)間來分離蛋白。該方法廣泛用于尋找疾病蛋白標(biāo)記。我們采用了SELDI-TOF MS的觀察大鼠急性心肌缺血后的血清蛋白變化規(guī)律，尋找能作為心肌缺血的蛋白標(biāo)記。同時(shí)我們也觀察了心肌本身蛋白質(zhì)譜的改變。 方法SD大鼠分成手術(shù)組，假手術(shù)組和非手術(shù)對(duì)照組。在結(jié)扎大鼠冠脈前降支，在5 min-6 h內(nèi)不同的時(shí)間段取大鼠的靜脈血和心肌組織。血清和心肌組織的蛋白提取物分別經(jīng)過化學(xué)芯片的初步篩選后均選定CM10芯片作為實(shí)驗(yàn)用芯片。用Ciphergen公司的PBSⅡ-C型SELDI-TOF MS質(zhì)譜儀檢測(cè)。同時(shí)血清進(jìn)行了cTnI和CKMB的檢測(cè)，心肌進(jìn)行常規(guī)HE染色。 結(jié)果只出現(xiàn)于手術(shù)組而幾乎不出現(xiàn)于假手術(shù)組和非手術(shù)對(duì)照組的峰為特異峰；出現(xiàn)于手術(shù)組和假手術(shù)組而在非手術(shù)組中不出現(xiàn)的峰稱非特異峰。血清CM10芯片檢測(cè)到3個(gè)心肌缺血特異性峰，質(zhì)荷比(m／z)分別是7564 Da、7586 Da、9583 Da。其中7564 Da、7586 Da相伴出現(xiàn)，在缺血5min組陽性率50％，在15 min以后各缺血組的陽性率達(dá)到97％，在假手術(shù)組僅有1個(gè)樣本有這兩個(gè)峰，未見于非手術(shù)組，特異性達(dá)到97％。9583 Da僅存在于缺血后1 h以內(nèi)。發(fā)現(xiàn)價(jià)在手術(shù)組和假手術(shù)組都出現(xiàn)的非心肌特異性峰(4983 Da、5140 Da、8075 Da、9423 Da)。4個(gè)峰值改變的非特異性峰：3個(gè)升高的峰(4400 Da、4542 Da、8400 Da)，1個(gè)在假手術(shù)組和手術(shù)組都降低的峰(7666 Da)。 缺血心肌組織同兩個(gè)對(duì)照組比較，，主要有兩種差別峰：特異性出現(xiàn)的新峰和峰值升高的峰。特異性出現(xiàn)的新峰3個(gè)：質(zhì)荷比(m／z)分別為6304Da、8337 Da、8376 Da，這三個(gè)峰在手術(shù)組中陽性率為100％，假手術(shù)組和非手術(shù)組中均沒有發(fā)現(xiàn)，其中峰6304 Da，8337 Da在手術(shù)5 min后就升高，8376 Da也是在缺血5 min后出現(xiàn)，15 min后峰值明顯升高。特異性升高的峰3個(gè)：其中質(zhì)荷比(m／z)為6658 Da、6876 Da兩個(gè)峰都是在實(shí)驗(yàn)組中15 min以后升高2倍以上，8577 Da峰則在缺血5 min以后升高。cTnI和CKMB在血清中的含量分別均在4 h以后升高。HE染色在1 h可見心肌收縮帶，4-6 h可見有炎癥細(xì)胞浸潤。 結(jié)論血清中出現(xiàn)7564 Da、7586 Da蛋白峰，缺血心肌組織中出現(xiàn)6304Da、8337 Da、8376 Da蛋白峰都是急性心肌缺血后的特異性改變，是目前已知檢測(cè)出的最早的蛋白標(biāo)記物。有望用于臨床心肌缺血的早期診斷和法醫(yī)學(xué)心源性猝死的診斷。 第二部分大鼠急性心肌缺血后差異基因的篩選 背景了解心肌缺血后早期分子變化的機(jī)制，對(duì)于尋找疾病的標(biāo)記和干預(yù)治療缺血性心肌病意義重大。目前關(guān)于心肌缺血在轉(zhuǎn)錄水平上的研究多采用cDNA芯片的方法，該方法用已知的EST和基因做探針，其結(jié)果取決于芯片上探針的密度，而且對(duì)于低表達(dá)的RNA效果差，更無法了解可能出現(xiàn)的新基因。抑制消減雜交(SSH)是一種從轉(zhuǎn)錄水平比較兩種材料mRNA差異的方法，其設(shè)計(jì)方法從一定程度上彌補(bǔ)了DNA芯片的不足。我們用該方法檢測(cè)了大鼠心肌缺血后的差異表達(dá)基因。 方法8只SD大鼠心肌缺血1 h后處死，提取純化mRNA，以缺血心肌作為Tester，非缺血自身對(duì)照作為Driver，進(jìn)行正向雜交，以非缺血心肌作為Tester，缺血心肌作為Driver進(jìn)行反向雜交。擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建消減cDNA文庫，經(jīng)過測(cè)序和斑點(diǎn)雜交的確認(rèn)后，得到不同基因的克隆片斷，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)分析。 結(jié)果正向雜交得到的已知基因有16個(gè)：分為以下五類：(1)心肌和細(xì)胞骨架：myoglobin，troponin T2，cardiac(Tnnt2)，tropomyosin 1 alpha(Tpm1)，Rattus norvegicus beta-glo(MGC72973)。(2)蛋白翻譯相關(guān)：ribosomal protein L39，ribosomal protein S11(Rps11)，eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1(Eef1a1)。(3)代謝以及相關(guān)酶類：ATPase 3(Psmc3)，malate dehydrogenase 1 NAD，lactate dehydrogenase B(Ldhb)，UDP-glucose pyrophosphorylase 2(Ugp2)。(4)心肌重塑相關(guān)：cathepsin L(Ctsl)。(5)其他：Sjogren syndrome antigen B(Ssb)，basigin(Bsg)，unc-45 homolog A(Unc45a)。反向雜交的到的已知基因有1個(gè)氧化還原相關(guān)蛋白NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2(Ndufs2)。共獲得新克隆16個(gè)，其中9個(gè)可以在REFRNA庫中查到并可根據(jù)NCBI的DNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其功能：7個(gè)核糖體相關(guān)，一個(gè)為Telethonin，一個(gè)為actin。另外7個(gè)完全未知，無法根據(jù)DNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其可能序列和功能。其中Sjogren syndrome antigen B(Ssb)，basigin(Bsg)，unc-45 homolog A(Unc45a)，cathepsin L(Ctsl)，Telethonin均為第一次發(fā)現(xiàn)與早期心肌缺血有關(guān)。其功能尚需進(jìn)一步證實(shí)。 結(jié)論我們構(gòu)建了大鼠心肌缺血后的消減雜交文庫。五個(gè)基因第一次報(bào)道與心肌缺血有關(guān)，分別是Sjogren syndrome antigen B(Ssb)，basigin(Bsg)，unc-45 homolog A(Unc45a)，cathepsin L(Ctsl)和Telethonin，發(fā)現(xiàn)了7個(gè)新的EST與心肌缺血相關(guān)的序列。
[Abstract]:Screening of early markers of acute myocardial ischemia in rats by first partial SELDI - TOF MS





Background The incidence of coronary heart disease in China increased year by year , mortality and disability rate remained high , and it was the main cause of sudden death of forensic medicine .





SELDI - TOF MS is a new protein group analysis tool in recent years . The principle is that proteins and polypeptides of different properties are combined with chemical chips of different properties . The proteins are separated by laser excitation after binding energy molecules . The method is widely used to find disease protein markers . We use SELDI - TOF MS to observe the changes of serum protein after acute myocardial ischemia . We also observed the changes of protein spectra of myocardium itself .





Methods SD rats were divided into operation group , sham operation group and non - operative control group . After ligation of the coronary artery , the venous blood and myocardial tissues of rats were taken for different time periods . The protein extracts of serum and myocardial tissue were selected as experimental chips after preliminary screening of chemical chips . Serum and CKMB were detected by using PBS 鈪

本文編號(hào)：2062990