發(fā)布時間：2018-06-12 12:36

  本文選題：MN基因型 + 原位PCR　； 參考：《中國醫(yī)科大學(xué)》2004年碩士論文

【摘要】： 前言 個人識別是以個人為研究對象，包括活體，尸體及來源于人體的生物學(xué)性檢材，應(yīng)用法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)的理論和技術(shù)檢測分析，確定其個體的身源。 遺傳標(biāo)記檢測是個人識別最可靠、最確切的手段。DNA遺傳標(biāo)記多態(tài)性檢測技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是具有靈敏度高、特異性強、適用于降解DNA檢材、檢測方法操作簡單、節(jié)省時間等特點的PCR技術(shù)的應(yīng)用和普及，使法醫(yī)物證檢測由細胞水平發(fā)展到分子水平，由宏觀水平發(fā)展到微觀水平，由只能否定發(fā)展到可以肯定的水平，極大地擴展了法醫(yī)物證的應(yīng)用范圍，提高了法醫(yī)物證鑒定的質(zhì)量。 法醫(yī)實踐中某些案件卻經(jīng)常要求我們對送檢的特殊檢材—福爾馬林固定后的人體組織(石蠟包埋塊或病理切片)進行同一認定和個人識別。例如：罪犯保外就醫(yī)提供的是否本人的病理組織和切片，或者是保險理賠時提供的他人的惡性腫瘤病理切片，或是病理室工作中偶爾遇到標(biāo)本的標(biāo)記錯誤，發(fā)現(xiàn)與臨床資料不匹配時等案件都需要對這種特殊檢材的組織來源進行鑒定，石蠟包埋組織或者切片的DNA分型鑒定在實踐中已經(jīng)愈發(fā)重要。 本研究應(yīng)用靈敏度高、特異性好的原位PCR技術(shù)，測定福爾馬林固定不同時間的石蠟切片組織MN血型的基因型，并對蛋白酶消化時間等主要影響因素進行了初步的研究，以建立一種穩(wěn)定、實用的檢測石蠟組織切片DNA遺傳標(biāo)記的方法，為法醫(yī)物證鑒定和個人識別提供一種新的檢測手段。 材料與方法 樣本來源和處理：樣本來源：樣本血液2ml、肌肉組織200mg各12例，分別取自本校法醫(yī)病理教研室12例解剖尸體(死亡后48小時內(nèi)，未腐敗尸體)。12例血液樣品制懸液備檢。同時酚/氯仿法常規(guī)提取DNA。每例肌肉組織分別按照10％福爾馬林固定24h、48h、72h、3個月分組。石蠟包 埋，切5卜m厚切片數(shù)張。運用直接凝集法檢測紅細胞MN表型。運用常規(guī) PCR檢測樣本血液MN基因型。石蠟切片進行原位PCR檢，預(yù)處理分別滴 加loom歲血的蛋白酶K20閃消化，以原位擴增顯色后陽性細胞占總細胞 的比值75%為標(biāo)準(zhǔn)，確定最適消化時間〔‘，〕，研究不同固定時間與蛋白酶 消化的相互影響和關(guān)系，同時檢測石蠟切片的MN基因型。 結(jié)果 血清學(xué)檢測12例樣本MN表型結(jié)果、PCR檢測結(jié)果與原位PCR檢測 MN基因型結(jié)果完全相同:12例被檢樣本，1、6、7、n號4個樣品基因型為’ MM型;2、4、8、9、12號5個樣本基因型為NN型;3、5、10號3個樣本基因型 為MN型。 固定時間為24h、48h、72h、3個月組所需最適宜的蛋白酶消化時間分別 為30.41土6.55而n、46.67土6.38min、56.25士8.49而n、58.33土6. 38而n。 統(tǒng)計學(xué)分析表明不同固定時間分組所需蛋白酶最適消化時間存在顯著差異 (P0 .01)。 討論 在法醫(yī)物證實踐中，經(jīng)過化學(xué)處理的特殊檢材，例如福爾馬林固定后的 石蠟包埋組織塊和切片的個人識別和來源鑒別，，因為福爾馬林介導(dǎo)的甲基 化直接影響DNA提取的效率，其中固定時間是一個重要的變異因素。在常 規(guī)方法提取DNA過程中，由于包埋組織中DNA發(fā)生降解，同時DNA提取 過程中，機械和化學(xué)的作用，也最容易導(dǎo)致模板DNA污染和造成DNA破 壞。 本研究根據(jù)文獻合成了兩條MN序列特異性引物，分別與一條共同引 物構(gòu)成兩個可以分別檢測M、N基因的PCR反應(yīng)體系。運用原位PCR技術(shù) 來對組織切片進行DNA分型，避免了提取過程中的破壞和污染，在切片上 直接進行PcR反應(yīng)進行組織切片的MN基因型檢側(cè)。12例樣品基因分型 結(jié)果與血清型分型結(jié)果完全一致。表明本研究合成的引物質(zhì)量良好，PCR 擴增條件選擇適宜〔‘，1。 本研究采用的是直接原位PCR檢測方法，即在PCR反應(yīng)液中，按一定 比例用Bi。一n一dUTP代替dT]叩，在PCR反應(yīng)中，Bio一n一dUTP摻人到 擴增的目的片段中，然后用親和素化的酶顯色系統(tǒng)顯色觀察。 本研究結(jié)合臨床病理診斷實際和法醫(yī)物證實踐，對10%福爾馬林固定 時間分別為24h，48h，72h和3個月的肌肉組織分組進行蛋白酶消化時間的 梯度研究，通過蛋白酶消化時間的篩選實驗，來研究固定時間和蛋白酶消化 時間的相互影響和關(guān)系，成功地對固定時間從24h到3個月的組織石蠟包 埋切片進行了MN血型的檢測，從而為法醫(yī)物證實踐提供原位PCR檢測組 織切片的實驗條件。 研究表明:PCR信號強弱與福爾馬林固定時間和蛋白酶消化程度密切 相關(guān)，而最適宜的蛋白酶消化時間決定于福爾馬林固定時間，蛋白酶消化時 間隨著固定時間的增長而遞增，這種強相關(guān)性使得充分的蛋白酶消化在原 位PCR檢測中非常重要，蛋白酶消化不充分是原位PcR失敗的最常見的原 因。 組織標(biāo)本經(jīng)蛋白酶消化后可增加通透性，使反應(yīng)試劑進人細胞內(nèi)，并暴 露靶核酸序列。消化不足可導(dǎo)致細胞通透性差，蛋白質(zhì)與核酸之間廣泛交 聯(lián)，出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而過度消化則可能造成細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞，同時導(dǎo) 致擴增產(chǎn)物彌散，造成假陽性結(jié)果。我們對比了幾種不同消化方式，確定以 100協(xié)擴mL的蛋白酶K溶液、針對不同固定時間的組織進行消化，可達到較 佳結(jié)果。 將原位PCR技術(shù)運用于法醫(yī)血清學(xué)的個人識別和同一認定，目前國內(nèi) 外還?
[Abstract]:Foreword









Personal identification is an individual research object , including living body , body and biological sample derived from human body , applying forensic science , anthropology theory and technology detection analysis , to determine the body source of its individual .









Genetic marker detection is the most reliable and accurate method for personal identification . The application and popularization of DNA genetic marker polymorphism detection technology in forensic medicine field , especially the application and popularization of PCR technique with high sensitivity and specificity , is suitable for degrading DNA sample , detection method has simple operation , time saving and so on .









Some cases in the practice of forensic medicine often ask us to conduct the same identification and personal identification of the special sample - formalin - fixed human tissue ( paraffin embedded block or pathological section ) after the examination . For example , it is important to identify the tissue source of the special test material , and the paraffin embedding tissue or the DNA typing of the slice has become more and more important in practice .









In order to establish a stable and practical method for the detection of DNA genetic markers in paraffin sections , a new method for the identification of forensic evidence and personal identification was provided .









Materials and Methods









Sample source and treatment : sample source : sample blood 2ml , muscle tissue 200 mg each 12 cases , taken from 12 autopsy bodies ( within 48 hours after death , uncorrupted body ) from the department of forensic pathology of our school . 12 cases of blood sample suspension preparation . Meanwhile , the DNA was routinely extracted by phenol / chloroform method . Each muscle tissue was fixed for 24h , 48h , 72h , and 3 months according to 10 % formalin , respectively . Paraffin bag



















The expression of erythrocyte MN phenotype was detected by direct agglutination test , and routine test was used to detect the phenotype of erythrocyte MN .









The blood MN genotype of sample was detected by PCR . The paraffin sections were subjected to in - situ PCR and pre - treatment respectively .









The protease K20 was digested with proteinase K20 , and the positive cells in situ were used to make up the total cells .









The ratio of 75 % was the standard , the optimal digestion time was determined &bra; ' , &ket; , the different fixing time and protease were studied . The mutual influence and the relationship between digestion and the MN genotype of paraffin sections were also detected . Results Serologic test of 12 samples of MN phenotype results , PCR detection results and in situ PCR detection The results of MN genotype were identical : 12 samples were tested , 1 , 6 , 7 , and 4 samples were of the same genotype .









Type MM ; 2 , 4 , 8 , 9 , 12 5 samples genotype NN ; 3 , 5 , 10 3 sample genotypes









is of the mn type .









the time of fixation is 24 h , 48 h , 72 h , the most suitable protease digestion time required for the 3 month group is









For 30.41 soil 6.55 , n , 46.67 soil 6.38min , 56.25 + 8.49 and n , 58.33 soil 6.38 and n .









The statistical analysis indicated that there was a significant difference in the optimal digestion time of protease required for different fixation time groups .









(P0 .01).










discuss









in that practice of forensic evidence , a special sample of chemical treatment , such as formalin fix ,









Individual identification and source identification of paraffin - embedded tissue blocks and slices , as formalin - mediated methyl









The efficiency of DNA extraction is directly affected , and the fixed time is an important variation factor .









in that proces of extracting DNA by the method , the DNA in the embedding tissue is degraded , and the DNA extraction









During the process , mechanical and chemical effects are most likely to lead to DNA contamination of the template and DNA damage









Bad .









Two specific primers of MN sequence were synthesized according to the literature .









The PCR reaction system can be used for detecting M and N genes respectively .









DNA typing of the tissue slices is carried out , the damage and the pollution in the extraction process are avoided ,









The genotype of MN genotype of tissue sections was examined by direct PCR reaction . 12 samples were genotyped .









Results The results were completely consistent with the results of serotyping . The results showed that the quality of the synthesized primers was good , PCR was carried out .
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：D919

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 李莉,闕庭志,林源,龔毓昌;甲醛固定組織中DNA提取與擴增技術(shù)的初步研究[J];法醫(yī)學(xué)雜志;1998年02期

2 孫文東,鄧國仁,李吉友;從石蠟包埋和甲醛浸泡組織中提取DNA進行PCR擴增的研究[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1991年01期

3 張建中，朱元曉，王建安，鄭建強;石蠟包埋組織的DNA提取及其在免疫球蛋白基因重排分析中的應(yīng)用[J];生物化學(xué)與生物物理進展;1994年03期

本文編號：2009698