本文選題：八肽膽囊收縮素 + 脂多糖　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2007年博士論文

【摘要】： 內毒素休克(endotoxic shock, ES)是臨床各科常見的危重病理過程,內毒素休克及其合并癥多器官功能障礙綜合癥是ICU患者最常見的死亡原因。在內毒素休克的發(fā)病早期,體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)進行性降低是其特征性病理變化。內毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及其誘導機體產生的促炎細胞因子可引起血管調控超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase, iNOS)的異常表達,氧自由基、一氧化氮(nitric oxide,NO)等生成增多,干擾血管的調節(jié)機制,可能是ES早期血壓降低的重要原因。 膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是一種神經(jīng)調節(jié)肽,廣泛分布于機體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫器官以及心血管系統(tǒng),參與調節(jié)機體多種生理功能及病理過程。以往研究多偏重關注其拮抗阿片鎮(zhèn)痛、消化內分泌等領域,近年來小分子八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)的心血管功能調節(jié)及細胞保護作用正成為研究的新熱點。已有報道給清醒Long Even鼠靜脈注射低劑量CCK-8,可引起腎、腸系膜和后下肢動脈收縮,大劑量則引起動脈舒張。本室的系列研究發(fā)現(xiàn)CCK-8具有明確的抗內毒素休克作用,可提高血管SOD的活性,抑制LPS誘導的血管平滑肌細胞iNOS活性增加、NO生成增多,緩解LPS誘導的血管反應異常變化,逆轉ES大鼠MAP的下降及ES早期的肺動脈壓升高,減輕各臟器病理損傷,明顯降低內毒素休克大鼠的死亡率。CCK通過其靶細胞表面的CCK受體(CCK-R)發(fā)揮其生物學作用, CCK-R屬于G蛋白偶聯(lián)受體,根據(jù)其對內源性配基親和力的不同可分為CCK-AR和CCK-BR 2種亞型。研究表明CCK受體非特異性阻斷劑丙谷胺及CCK-AR/BR的特異性阻斷劑CR-1409/2945可拮抗CCK-8的抗ES作用。 LPS介導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)活化的信號通路錯綜復雜。目前認為核因子кB (nuclear factor-kappa B,NF-кB)是參與LPS誘導細胞損傷的重要轉錄因子;LPS—LBP—PKC/ PTK—IKK—IκB—NF-κB—kinase是2條關鍵的信號通路,即LPS與LPS結合蛋白(LPS-binding protein,LBP)結合形成LPS受體復合物,募集適配分子MyD88,MyD88的死亡結構域再激活下游的相關激酶,包括NF-κB誘導激酶(NF-κB-inducing kinase NIK)和蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶(PKC/PTK),激活的NIK或PKC/PTK都能獨自活化IκB激酶(IκB kinase, IKK)復合物,導致IκB磷酸化降解,NF-κB移位入核,啟動目的基因轉錄。研究證實CCK-8對內毒素血癥肺組織、LPS誘導肺巨噬細胞NF-кB活性增加有抑制性調節(jié)作用。而CCK-8對LPS誘導VSMC活化的信號通路影響鮮有報道。 鑒于VSMC是血管的功能細胞,本課題在我室系列研究的基礎上,以體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細胞(thoracic aortic smooth muscle cells, TASMCs)為研究對象,擬觀察CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs iNOS和不同類型SOD表達的影響及其信號轉導機制,以及CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs阿片受體表達的影響及其在受體水平的交互作用,以進一步探討CCK-8緩解ES大鼠血管功能障礙的分子機制。 1 CCK-8抑制LPS誘導大鼠TASMCs iNOS表達的受體機制研究 1. 1 CCK受體在大鼠TASMCs中的表達及LPS的影響 目的:為了探討CCK受體在大鼠TASMCs中的表達及不同劑量及不同時間LPS對CCK受體表達的影響。 方法:用貼塊法培養(yǎng)大鼠TASMCs,給予LPS (0.1mg/L)孵育細胞不同時間,采用RT-PCR及免疫細胞化學技術檢測CCK-AR和CCK-BR的基因和蛋白表達及LPS對其表達的影響。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1) CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白在大鼠TASMCs中均有表達。CCK-AR mRNA RT-PCR擴增片段為1.37kb,CCK-BR mRNA RT-PCR擴增片段為480bp。以β-actin做內參對照,片段長度為450bp。 (2) CCK-AR mRNA平均表達水平(與β-actin的AU比值):對照組為0.3654±0.132%,LPS組1h、2h、4h、8h分別為0.7172±0.117%、1.7211±0.103%、0.8036±0.175%、1.1315±0.18%,較對照組均有顯著增加(P0.05),其中2h表達最高(P0.01),4h時略有下降,8h又有所回升;CCK-BR mRNA平均表達水平對照組為0.9115±0.106%,LPS組1h, 2h, 4h, 8h分別為1.0424±0.094%、1.9741±0.194%、1.3329±0.062%、1.1599±0.108%,較對照組有顯著增加(P0.05),其中2h表達最高。且CCK-BR的相對表達量高于CCK-AR(p0.05)。 (3) CCK-AR和CCK-BR均為膜蛋白。免疫細胞化學技術檢測結果顯示,對照組TASMCs細胞膜及細胞漿有CCK-AR和CCK-BR的陽性表達(陽性率為每十個高倍視野大于5%),LPS(0.1mg/L)孵育TASMCs 2h,可見2種蛋白表達均上調,其中CCK-BR蛋白表達高于CCK-AR。 結論:在體外培養(yǎng)的大鼠TASMCs中存在著CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白的表達;LPS可誘導其表達上調。 1. 2 CCK-8抑制LPS誘導大鼠TASMCs iNOS表達的受體機制 目的:前面的實驗已證實了大鼠TASMCs有CCK-AR和CCK-BR mRNA及蛋白的表達,且LPS可誘導其表達上調。內毒素休克時,血管平滑肌細胞合成大量誘導型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase, iNOS),從而導致舒血管因子一氧化氮(nitric oxide,NO)超量產生,是ES早期血管舒張、血壓降低的重要原因之一。但TASMCs作為ES血管反應的關鍵效應細胞,CCK-8對其iNOS表達及其受體作用機制有何影響尚未見報道。本部分將主要觀察CCK-8對LPS誘導TASMCs iNOS表達及CCK-AR拮抗劑CR-1409和CCK-BR拮抗劑CR-2945對其的影響,以闡明CCK-8的抗休克作用機制。 方法:培養(yǎng)大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CCK受體拮抗劑CR-1409/CR-2945的情況下,給予LPS刺激細胞16h,用RT-PCR技術檢測細胞iNOS mRNA的表達;Western blot技術檢測胞漿iNOS蛋白表達,以光密度值表示其相對含量。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1) TASMC自發(fā)性產生iNOS的量非常少,低于我們檢測的下限。 (2) LPS(0.1mg/L)可顯著增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表達(P0.01),分別是對照組的3.81、4.16倍。 (3) CCK-8可抑制LPS的這種作用(P0.01),且在10~(-10)、10~(-8)、10~(-6) mol/L濃度呈劑量依賴性。 (4)預先給于CCK -AR特異性拮抗劑1409(10~(-5) mol/L)、CCK -BR特異性拮抗劑2945(10~(-5) mol/L),二者均可部分拮抗CCK-8的這種抑制作用;且預先給予CR-1409后,細胞iNOS基因表達量與CCK-8+LPS組相比升高了52.96%(P0.01),蛋白表達量升高了33.7%(P0.01);而預先給予CR-2945處理后,iNOS基因表達量與CCK-8+LPS組相比升高了42.16%(P0.01),蛋白表達量升高了23.56%(P0.05)。這說明CR-1409和CR-2945的拮抗作用主要發(fā)生在基因水平,而且在相同濃度的CR-1409和CR-2945情況下,CCK-AR特異性拮抗劑CR-1409對CCK-8下調iNOS表達的抑制作用更強,提示在CCK-8該效應中CCK-AR的作用強于CCK-BR。CCK-8、1409、2945單獨作用與對照組相比無顯著差異(P0.05)。 結論: LPS可增加TASMCs中iNOS mRNA及蛋白的表達;CCK-8抑制了LPS的這種作用; CCK-8的這種抑制作用是由其靶細胞膜上特異性受體介導的,且CCK-AR的作用略強于CCK-BR。 2 CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的信號轉導機制初探 2. 1 PTK通路參與CCK-8對LPS誘導的大鼠TASMCs NF-κB活性的影響 目的:NF-κB是內毒素休克過程中重要的轉錄因子,蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase ,PTK)作為NF-κB的上游蛋白,介導細胞多種不同的信號轉導途徑。本部分主要研究CCK-8是否影響LPS誘導TASMCs中NF-κB活性變化及PTK是否參與這一過程,以闡明CCK-8的抗休克信號轉導機制。 方法:培養(yǎng)大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或PTK特異性拮抗劑Genistein的情況下,用LPS刺激細胞一定時間,用電泳遷移率改變分析(EMSA)方法檢測細胞NF-κB活性變化;用Western blot技術分析細胞胞漿中IκB蛋白的表達水平;用免疫細胞化學分析技術觀測P65蛋白的核轉位。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1)用LPS(0.1mg/L)孵育TASMCs 1h,細胞內NF-κB活性明顯高于溶劑對照組(P0.01);而CCK-8劑量依賴性地抑制了LPS誘導的NF-κB活性增高,10~(-10)、10~(-8)、10~(-6) mol/L CCK-8的抑制率分別為27%、66%和80%(P0.05,P0.01);而預先給予Genistein (10~(-5) mol/L),NF-κB活性受抑更明顯,與LPS組及LPS+CCK-8組相比有顯著差異(P0.05 , P0.01);CCK-8及Genistein單獨孵育對細胞NF-κB活性無明顯影響(P0.05)。用同源性寡核苷酸(含NF-κB結合位點)及異源性寡核苷酸(含AP-2結合位點)作為競爭物證實了DNA-蛋白結合的特異性。 (2)用免疫細胞化學技術檢測TASMCs P65蛋白,對照組可見細胞漿呈強陽性表達,即胞漿內有大量棕黃色顆粒,而細胞核表達極弱,用LPS孵育細胞1h,胞漿P65蛋白明顯降低(P0.01)、胞核P65蛋白顯著增高(P0.01);CCK-8 (10~(-10)-10~(-6) mol/L)預處理可劑量依賴性抑制LPS處理的胞漿P65蛋白水平降低(P0.01)及核P65蛋白水平增高(P0.01);而預先10min加入Genistein,胞漿P65蛋白水平增高及胞核P65蛋白水平降低更顯著,與LPS組相比有顯著差異(P0.01);CCK-8及Genistein單獨孵育對P65蛋白水平無明顯影響。 (3) LPS孵育TASMCs 30 min,IκBα蛋白水平明顯降低(P0.01); CCK-8(10-8-10-6 mol/L)可增加LPS處理的TASMCs內IκBα蛋白水平(P0.05),呈劑量依賴性;而預先給予Genistein(10~(-5) mol/L),TASMCs內IκBα蛋白水平增加更明顯,與LPS組相比有顯著差異(P0.05),但與LPS+CCK-8組相比無顯著差異(P0.05);CCK-8或Genistein單獨孵育對細胞IκBα蛋白無明顯影響(P0.05)。 結論:CCK-8可抑制LPS誘導的NF-κB活性增加,而PTK參與了這一過程,這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的上游信號轉導機制之一。 2. 2 CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的信號轉導機制 目的:超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)是機體清除自由基的重要抗氧化酶,可清除超氧陰離子;而內毒素休克的發(fā)病早期,體循環(huán)血管舒張、平均動脈壓進行性降低與氧自由基的生成增多密切相關。我們的研究表明, CCK-8具有一定的抗內毒素休克作用,可增強SOD的活性,翻轉LPS導致的SOD活性降低;抑制LPS誘導的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達的增高。本試驗第二部分(1)已證實CCK-8可抑制LPS誘導的NF-κB活性增加,且PTK參與了這一過程。然而,CCK-8抑制LPS誘導的大鼠TASMCs SOD表達的的信號轉導機制尚未闡明。鑒于NF-кB是參與LPS誘導細胞產生自由基的重要轉錄因子,為進一步闡明CCK-8抗內毒素休克效應的分子機制,本部分內容主要觀察Gen作用于CCK-8和LPS共同孵育的TASMCs后,Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達的變化。 方法:培養(yǎng)大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或Genistein的情況下,用LPS刺激細胞一定時間,用半定量RT-PCR檢測SOD mRNA表達。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1)對照組TASMCs存在著Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA基礎表達; (2)加入LPS處理細胞4h,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表達均明顯上調,與對照組相比有顯著差異(P0.05); (3) CCK-8(10~(-8)mol/L)預先處理30 min、再加入LPS,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表達上調可部分抑制,與LPS組相比有顯著差異(P0.01);CCK-8或Genistein單獨處理,Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表達明顯下調,與對照組有顯著差異(P0.05); (4)預先10min加入Genistein,則Mn SOD、Cu-Zn SOD mRNA表達受抑更明顯,與LPS組相比有顯著差異(P0.01),但與LPS+CCK組相比無顯著差異(P0.05)。 結論:CCK-8可抑制LPS誘導的Cu-Zn SOD及Mn SOD mRNA表達的增高,且PTK介導了這一過程,這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的信號轉導機制之一。 3 CCK-8對LPS誘導的大鼠TASMCs阿片受體表達的分子機制 3. 1 CCK-8及其受體對LPS誘導大鼠TASMCs阿片受體表達的影響 目的:阿片受體存在多種亞型,包括μ、κ、δ、σ、ε、λ、ζ等7種,廣泛分布于神經(jīng)及其它系統(tǒng),通過與阿片肽相互作用,介導許多生理、病理活動。已有報道動物與人的血管壁上存在阿片受體;阿片受體可參與失血性休克;非特異性阿片受體阻斷劑naloxone具有抗內毒素休克作用。但TASMCs是否存在κ阿片受體?CCK-8對其表達的影響如何尚未明了。本部分內容主要觀察CCK-8、CR-1409和CR-2945、κ阿片受體特異性拮抗劑Nor-BNI作用于LPS孵育的TASMCs后,κ阿片受體mRNA表達的變化,以闡明κ阿片受體在內毒素休克中的作用。 方法:培養(yǎng)大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CR-1409和CR-2945、Nor-BNI的情況下,用LPS刺激細胞16h,用半定量RT-PCR檢測κ阿片受體mRNA的表達。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1)對照組TASMCs存在著κ阿片受體mRNA的基礎表達; (2)加入LPS處理細胞,κ阿片受體mRNA表達明顯上調,與對照組相比有顯著差異(P0.01); (3) CCK-8(10~(-6)、10~(-8)、10~(-10)mol/L)預先處理30 min、再加入LPS,κ阿片受體mRNA表達上調可部分抑制,并呈劑量依賴性,與LPS組相比有顯著差異(P0.05); (4)預先10min加入Nor-BNI,再給予LPS和CCK-8,κ阿片受體mRNA表達受抑更明顯,與LPS組及LPS+CCK組相比有顯著差異(P0.05); (5)預先10min加入CR-1409、CR-2945,再給予LPS和CCK-8,κ阿片受體mRNA表達受抑均有所增加;其中LPS+CCK+CR-2945組與LPS+CCK組相比有顯著差異(P0.05),但LPS+CCK+CR-1409組與LPS+CCK組相比無顯著差異(P0.05); (6) CCK-8、CR-1409和CR-2945、Nor-BNI單獨處理,κ阿片受體mRNA表達均輕微上調,但與對照組無顯著差異。 結論:CCK-8通過其受體抑制了LPS誘導的TASMCsκ阿片受體mRNA表達的增高,說明內毒素休克過程中,CCK-8與阿片受體之間在基因水平有交互作用,這可能也是CCK-8抗內毒素休克作用的機制之一。 3. 2 CCK-8對LPS誘導的大鼠TASMCs阿片受體表達的分子機制 目的:蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)是一個由十多個成員組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,廣泛分布于多種組織、器官和細胞中,對細胞的生長、代謝、增殖和分化起著重要的調節(jié)作用。我們前面的實驗已證實,CCK-8可通過其受體抑制LPS誘導的κ阿片受體mRNA表達增加,但其作用的信號轉導機制還未完全明了。本部分內容主要觀察PKC拮抗劑白屈菜赤堿(chelerythrine, CHE)、嗎啡作用于CCK-8和/或LPS孵育的TASMCs后κ阿片受體mRNA表達變化,以闡明CCK-8調節(jié)LPS誘導大鼠TASMCsκ阿片受體表達的分子機制。 方法:培養(yǎng)大鼠TASMCs,在加入或不加入CCK-8和/或CHE、嗎啡的情況下,用LPS刺激細胞16h,用半定量RT-PCR檢測κ阿片受體mRNA的表達。數(shù)據(jù)用x±s表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析,用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較,P0.05為有顯著性差異。 結果:(1)預先10min加入CHE,再給予LPS和CCK-8,則κ阿片受體mRNA表達受抑更明顯,與LPS組及LPS+CCK組相比均有顯著差異(P0.01,P0.05); (2)預先10min加入嗎啡,再給予CCK-8,則κ阿片受體mRNA表達增加部分受抑,與嗎啡組相比有顯著差異(P0.05);而再加入LPS,κ阿片受體mRNA表達增加受抑有所緩解,與LPS+CCK組及CCK+嗎啡組相比均有顯著差異(P0.05); (3) CHE單獨處理,κ阿片受體mRNA表達均輕微上調,但與對照組無顯著差異;嗎啡單獨處理,κ阿片受體mRNA表達明顯上調,與對照組相比有顯著差異(P0.01)。 結論:CCK-8可通過PKC抑制LPS誘導大鼠TASMCsκ阿片受體mRNA表達的增高,這可能是CCK-8抗內毒素休克作用的信號轉導機制之一。 小結 本研究從受體、轉錄因子、與ES相關因子的基因及蛋白表達多個層次比較系統(tǒng)地研究了CCK-8對LPS誘導TASMCs的調節(jié)作用及其信號轉導機制,取得以下新發(fā)現(xiàn): 1. CCK-AR和CCK-BR在大鼠TASMCs中均有表達;LPS可明顯誘導其表達上調,其中CCK-BR的相對表達量高于CCK-AR。 2. CCK-8可劑量依賴性地抑制LPS引起大鼠TASMCs iNOS表達的增加,此作用是由其受體介導的。 3. CCK-8對LPS誘導大鼠TASMCs NF-κB的活化抑制作用,且PTK參與了此過程。 4. CCK-8可抑制LPS誘導大鼠TASMCs的Cu-ZnSOD、MnSOD mRNA表達,LPS-PTK-NF-κB-SOD通路可能是其信號轉導之一。 5. CCK-8可抑制LPS誘導大鼠TASMCs阿片受體基因表達的增高,且由CCK受體介導,說明內毒素休克過程中,CCK-8與阿片受體之間在基因水平有交互作用,且PKC參與了此過程。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：D919

【參考文獻】

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1 許順江,高維娟,姚玉霞,從斌;脂多糖對大鼠肺間質巨噬細胞CCK受體mRNA表達的影響[J];第二軍醫(yī)大學學報;2003年05期

2 開麗,胡德耀,劉良明;阿片受體拮抗劑對失血性休克大鼠血管收縮功能的影響[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年10期

3 馬麗琴;谷振勇;董國凱;李娜;高峰;劉霞;馬春玲;叢斌;凌亦凌;;CCK-8對LPS誘導大鼠血管平滑肌細胞SOD基因表達及NF-κB活性增高的影響[J];第四軍醫(yī)大學學報;2006年20期

4 黃新莉,凌亦凌,周曉紅,韋鵬,戴鴻雁;脂多糖誘導的肺動脈平滑肌細胞膽囊收縮素受體基因表達的變化[J];河北醫(yī)科大學學報;2004年04期

5 盛志勇;嚴重燒傷后多器官功能障礙綜合征的臨床防治策略[J];中華急診醫(yī)學雜志;2001年01期

6 梅林;中樞八肽膽囊收縮素對大鼠脊髓水平阿片肽心血管調節(jié)作用的拮抗效應[J];生理科學進展;1991年02期

7 許鐵;內源性阿片物質在內毒素和心源性休克中的作用機制研究[J];生理科學進展;1993年03期

8 谷振勇;過氧亞硝基陰離子介導內毒素致肺血管損傷及膽囊收縮素的保護作用[J];生理科學進展;2001年02期

9 朱文玉,金雨蓀;八肽膽囊收縮素對鏈佐霉素引起的小鼠糖尿病的保護作用[J];生理學報;1985年06期

10 梅林,韓濟生;八肽膽囊收縮素對抗阿片肽的中樞性降血壓作用[J];生理學報;1991年02期

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本文編號：1774858