本文選題：皮膚　切入點：損傷愈合　出處：《中國醫(yī)科大學》2007年博士論文

【摘要】： 皮膚切創(chuàng)愈合過程是機體保持組織完整性而產生的一個連續(xù)而復雜的過程，大致分為三個階段，即炎癥期、增生期和組織重建期，有多種細胞因子和炎癥細胞參與。研究表明，皮膚損傷愈合過程中保持細胞數量的平衡是通過程序性細胞死亡(programmed cell death)，即細胞凋亡(apoptosis)這一機制完成的[1]。我們的前期研究認為caspase家族成員可能參與皮膚損傷愈合過程中多型核細胞、單核細胞、成纖維細胞這三種細胞的凋亡，并且caspase家族成員有望成為用于皮膚損傷時間推斷的指標[4-5]。而且在皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase的表達、激活情況對參與損傷愈合中細胞凋亡的影響和對組織愈合的影響尚未見報道，也未見關于在體研究參與皮膚損傷愈合過程中細胞凋亡機制的研究報道。 Q-VD-OPH(Quinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxyl]-rr,ethyl ketone)是一種優(yōu)于Z-VAD-fmk和Boc-D-fmk的廣譜抑制劑。本實驗在切創(chuàng)的動物模型體內應用caspase廣譜抑制劑O-VD—OPH，抑制caspase級聯(lián)的激活，從而抑制caspase活性，并且應用免疫組織化學染色技術、比色法、Western blotting和RT-PCR技術等方法檢測各組小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase-3，-6，-7蛋白的表達、激活情況和mRNA的表達情況，從而闡述皮膚損傷愈合過程中細胞凋亡的機制和凋亡細胞的信號轉導途徑。 實驗材料和方法 1．健康成年清潔級昆明系小鼠162只，體質量30±2g，隨機分為3組：實驗組(Q-VD-OPH組)、對照1組(DMSO組)、對照2組(NaCI組)。每組小鼠又分成0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d時間段，每時間段6只小鼠。實驗切口前30min小鼠腹腔注射相應液體，乙醚氣體吸入麻醉，背部剪毛處理，常規(guī)手術消毒，在背部中央做一縱行長1.5cm皮膚全層切口，深達筋膜。每24h重復給藥一次。分別于傷后不同時間將小鼠脫頸椎處死，取傷口處1.0cm×1.5cm皮膚組織。部分固定后石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。部分所取皮膚組織用冷生理鹽水清洗后置于液氮內速凍，-70℃保存?zhèn)溆糜诘鞍子≯E分析和活性測定分析，部分用1‰DEPC水沖洗后用Trizol提取mRNA，用于RT-PCR分析。 2．常規(guī)H．E染色。 3．免疫組織化學染色(SP法)： 4．Western blotting分析； 5．Caspase-3，-6活性測定； 6．RT-PCR； 7．圖像分析與統(tǒng)計學處理 應用OLYMPUS BX 51顯微照相攝像系統(tǒng)(日本)、計算機顯微圖像分析系統(tǒng)(Meta Morph／DDIO／BX51)，×400倍下，在損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機選10個視野，計數包括多型核細胞、單核細胞、成纖維細胞在內的細胞總數和陽性細胞數。計算陽性細胞百分率，在SPSSll.O for windows軟件進行統(tǒng)計學方差分析。 Western blotting和RT-PCR分析結果應用Fluochem V2.0軟件(美國阿爾法公司，電泳凝膠圖像工作站)分析，作灰度掃描分析測定擴增條帶灰度值，用內參照β-actin修正比較各組表達水平的差異。結果采用方差分析。 實驗結果 第一部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中應用caspase抑制劑后皮膚損傷愈合過程的病理形態(tài)學變化 Q-VD-OPH實驗組愈合過程較對照組快。Q-VD-OPH組傷后6h出現(xiàn)多型核細胞浸潤，12h內可見大量浸潤的炎細胞，1d可見多型核細胞數量減少，3d單個核細胞堆積，成纖維細胞增生。5d肉芽組織增生明顯。7d可見大量的單個核細胞和長梭形細胞并可見大量的管腔樣結構。傷后10d肉芽組織增生明顯，14d形成增生性瘢痕。 第二部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對caspase-3，-6，-7表達影響的免疫組織化學研究 對照組中caspase-3，-6，-7陽性表達主要存在于多型核細胞、單個核細胞和成纖維細胞中(細胞種類主要根據形態(tài)來區(qū)分)，并且各時間段相鄰兩組caspase-3，-6，-7陽性細胞率存在顯著性差別(P＜0.01)，Q-VD-OPH組還可見肉芽組織內堆積的成纖維細胞大部分表達caspase-3陽性，陽性細胞率直至14d達到最高峰。而此時卻很少表達caspase-6，-7。實驗組陽性細胞率與對照組存在顯著性差別(P＜0.01)。 第三部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對caspase-3，-6，-7表達及其剪切影響的蛋白印跡分析 對照組caspase-3，-6，-7的表達存在時間規(guī)律性。Q-VD-OPH組隨損傷時間延長，caspase-3前體表達逐漸增多，直至14d達高峰，但實驗組未檢出caspase-3的活化片段；caspase-6，-7前體表達趨勢同對照組，但雜交強度明顯降低，而且只在1d-7d組檢出少量活化片段。與對照組存在顯著性差異。 第四部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中oaspase抑制劑對caspase-3，-6剪切及其活性變化的研究 對照組caspase-3活性倍數增值在12h和10d分別達高峰，Q-VD-OPH組對caspase-3的活性完全抑制。對照組caspase-6活性倍數增值在3d達高峰，Q-VD-OPH部分抑制了caspase-6的活性，與對照組各時間段相比均有顯著性差異。 第五部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對caspase-3，-6，7 mRNA表達水平影響的研究 對各組各時間段樣本進行RT-PCR實驗并進行相對灰度測定分析，發(fā)現(xiàn)對照組caspase-3，-6，-7mRNA的表達存在時間規(guī)律性。Q-VD-OPH組隨損傷時間延長，caspase-3mRNA表達逐漸增多，直至14d達高峰；caspase-6，-7mRNA表達趨勢同對照組，但雜交強度明顯降低。表明Q-VD-OPH可以影響caspase-3，-6，-7 mRNA的合成。 討論 近年的研究表明，caspase是負責執(zhí)行凋亡細胞中特異性酶切的關鍵蛋白酶，caspase蛋白酶家族是一類細胞凋亡調節(jié)因子家族，當受到一定的信號刺激后通過蛋白酶級聯(lián)反應順序激活，在細胞凋亡過程中起關鍵作用。結合近年來的研究結果，提示caspase-3，-6，-7極有可能是皮膚損傷愈合過程中誘導中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞凋亡的最終執(zhí)行因子。為進一步闡述caspase家族成員在皮膚損傷愈合過程中執(zhí)行細胞凋亡的作用，應用caspase抑制劑人為抑制其剪切和激活，觀察皮膚損傷愈合過程的變化和細胞凋亡的情況。 Q-VD-OPH作為新型的caspase廣譜抑制劑，通過抑制上游的啟動型caspase而發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。本實驗以前期動物實驗為基礎，通過在體應用Q-VD-OPH研究皮膚損傷愈合過程中細胞的凋亡機制，探討Q-VD-OPH對caspase-3，-6，-7的抑制情況和對細胞凋亡的影響。 本實驗的研究發(fā)現(xiàn)正常對照皮膚中檢出caspase-3前體的表達，表明casapse-3可能參與表皮基底層角朊細胞(kerotinocyte)的凋亡，并參與皮膚穩(wěn)態(tài)的維持。而且還檢出caspase-6的活性裂解片斷，說明caspase-6在正常皮膚中發(fā)揮維持穩(wěn)態(tài)和執(zhí)行皮膚新陳代謝相關的細胞凋亡的作用。 一、皮膚損傷愈合過程中中性粒細胞凋亡的機制 皮膚損傷愈合的早期，caspase-3、-6、-7被激活，尤其是在中性粒細胞浸潤的高峰時相內caspase-3的活性最高，說明在中性粒細胞的凋亡過程中caspase-3的激活發(fā)揮主要的作用。應用Q-VD-OPH后，caspase-3的激活被抑制，但中性粒細胞仍舊不發(fā)生堆積。說明其自發(fā)性凋亡還存在非caspase-3途徑，存在其他代償性途徑發(fā)揮執(zhí)行細胞凋亡的作用。 二、皮膚損傷愈合過程中單核細胞凋亡的機制 免疫組織化學染色結果表明對照組中浸潤和增生的單個核細胞中有caspase-3，-6，-7的表達，caspase-3，-6，-7的激活在單個核細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Q-VD-OPH抑制caspase-8，-9，-12的活性，并且抑制了caspase-3，-6，-7的活化。由于在Q-VD-OPH組內，，單個核細胞浸潤和增生的高峰時相內caspase-3的激活完全被抑制，但可檢出caspase-6，-7的活性片段，說明caspase-6，-7激活不單純由上游因子caspase-8，-9，-12刺激激活，或者我們使用的抑制劑濃度并未完全抑制caspase家族成員的活性，而且在單核細胞的凋亡過程中caspase-6，-7可能不起主要作用。 三、caspase-3，-6，-7在成纖維細胞凋亡和增生性瘢痕形成過程中的作用 caspase-3的激活在晚期肉芽組織向瘢痕組織轉化過程中發(fā)揮主要作用。caspase-6，-7亦參與成纖維細胞的凋亡。應用caspase抑制劑后，caspase-3激活片段完全被抑制，引起成纖維細胞大量堆積。Q-VD-OPH組內在10d和14d時間段上caspase-6，-7的激活被抑制進一步說明了caspase-6，-7的激活在成纖維細胞的凋亡和增生性瘢痕的形成過程中發(fā)揮重要的作用。 四、caspase-3，-6，-7在皮膚損傷愈合時間推斷上的應用 皮膚損傷愈合過程中caspase-3，-6，-7的陽性細胞率、Western blotting和caspase-3，-6以及RT-PCR結果表明caspase-3，-6，-7基因和蛋白的表達水平上存在時間規(guī)律性，進一步證實了caspase-3，-6，-7在皮膚損傷時間推斷上的應用價值。 五、DMSO對皮膚損傷愈合的影響及對caspaso活性的影響 DMSO可以較低程度地抑制caspase-3，-6，-7前體的表達和激活，其中對caspase-3的抑制作用較弱，而對CaSpase-6的抑制作用相對較強。 結論 1．皮膚切創(chuàng)愈合過程中應用Q-VD-OPH后造成皮膚的異常愈合，形成增生性瘢痕； 2．皮膚切創(chuàng)愈合過程中，Q-VD-OPH抑制單核細胞和成纖維細胞的凋亡過程，導致該類細胞的堆積，但并未影響浸潤的多型核細胞數目的減少； 3．皮膚切創(chuàng)愈合過程中Q-VD-OPH抑制caspase-3的激活，增加了caspase-3基因與前體的表達； 4．皮膚切創(chuàng)愈合過程中Q-VD-OPH抑制caspase-6，-7基因和前體的表達與激活； 5．皮膚切創(chuàng)愈合過程中組織中浸潤的中性粒細胞的凋亡可能與caspase-3的激活相關，當其激活被抑制時，可能出現(xiàn)其他代償性途徑執(zhí)行細胞凋亡； 6．caspase-3的激活可能是執(zhí)行皮膚切創(chuàng)愈合過程中組織中單個核細胞、成纖維細胞凋亡的關鍵因子；caspase-6，-7激活不單純由上游因子刺激激活，并且caspase-6，-7可能不是執(zhí)行單核細胞和成纖維細胞凋亡的關鍵因子； 7．DMSO可以較低程度的抑制caspase-3，-6，-7的表達和激活。其中對caspase-3的抑制作用較弱，對caspase-6的抑制作用較強。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：D919

【引證文獻】

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1 莊華梅;高溫對抗性和敏感小菜蛾caspase基因和hsp70基因熱激表達及抗性進化的影響[D];福建農林大學;2010年

本文編號：1716986