發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 21:04

【摘要】：探究水稻田生態(tài)系統(tǒng)反硝化微生物多樣性與土壤氮素循環(huán)之間的關(guān)系,是深入評(píng)價(jià)農(nóng)田土壤質(zhì)量與功能的新切入點(diǎn)。石灰性紫色水稻土是四川乃至全國都至關(guān)重要的農(nóng)業(yè)土壤,為保護(hù)該類土壤,四川省于20世紀(jì)80年代在遂寧市船山區(qū)建立了“NPK長期定位施肥”試驗(yàn)點(diǎn)。依托該平臺(tái),結(jié)合化學(xué)分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、系統(tǒng)發(fā)育分析、末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP)還有實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)等分子分析技術(shù),對(duì)不同施肥制度下石灰性紫色水稻土中的亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)和一氧化氮還原酶基因(nosZ)的群落結(jié)構(gòu)、豐度和垂直分布特征進(jìn)行分析。以期揭示反硝化細(xì)菌對(duì)不同施肥制度的響應(yīng)特點(diǎn)及在其土壤中的垂直分布特征,進(jìn)而認(rèn)識(shí)石灰性紫色水稻土生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)特征,為在該類土壤上建立合理氮肥施用制度、保護(hù)土壤質(zhì)量提供重要依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)對(duì)不同施肥制度下石灰性紫色水稻土理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示:相對(duì)于無肥處理,施肥會(huì)降低石灰性紫色水稻土 pH和硝態(tài)氮含量,而增加土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和氨態(tài)氮含量。隨土壤深度增加,土壤pH增加,全氮和硝態(tài)氮含量降低,氨態(tài)氮含量變化趨勢(shì)不明顯。根據(jù)硝態(tài)氮剩余量法測(cè)定反硝化酶活,結(jié)果顯示:0-20 cm層土壤的反硝化酶活明顯高于其他層次;其中氮磷肥施肥制度對(duì)反硝化酶活的促進(jìn)作用最明顯。皮爾遜相關(guān)分析顯示:反硝化酶活與pH值極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.46,p0.01),而與硝態(tài)氮極顯著正相關(guān)(r = 0.785,p0.01);而它與nosZ和nirS基因拷貝數(shù)無明顯相關(guān)性。反硝化酶活與nosZ基因群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)(p0.05由蒙特卡羅指數(shù)分析),而與nirS基因的群落結(jié)構(gòu)無明顯相關(guān)性。(2)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)16S rRNA和nirS、nosZ基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示:在0-20 cm層土壤,nirS和nosZ基因拷貝數(shù)均明顯高于其它層次。施肥制度對(duì)三種基因的拷貝數(shù)均有促進(jìn)作用,但無機(jī)肥配施農(nóng)家肥處理對(duì)16S rRNA和nosZ基因的拷貝數(shù)促進(jìn)作用更明顯;而nirS基因拷貝數(shù)對(duì)施肥制度的變化并不敏感。根據(jù)兩個(gè)功能基因所占16SrRNA比例,nosZ基因反硝化細(xì)菌在石灰性紫色水稻土中豐度更高。皮爾遜相關(guān)分析顯示:nirS和nosZ基因拷貝數(shù)均與土壤有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)。(3)利用DGGE對(duì)nirS基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,不同施肥制度下nirS基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的差異性。在0-20 cm層,無機(jī)肥配施有機(jī)肥的施肥制度下nirS基因反硝化細(xì)菌的多樣性指數(shù)和豐富度高于無機(jī)肥施肥制度,但其他層次間的差異不明顯。就土壤層次而言,在60-90 cm層,nirS基因反硝化細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度均最小。根據(jù)切膠回收條帶測(cè)序,共得到9條序列。3條序列未找到可培養(yǎng)菌株,剩余6條序列均屬于變形菌門。其中,大部分屬于β-變形菌門。(4)利用T-RFLP對(duì)nirS和nosZ基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明:nirS基因各土壤層次的T-RFs片段的豐富度變化不明顯;而nosZ基因在0-20 cm層土壤中豐富度最高。在0-20cm層土壤中明顯表現(xiàn)出無機(jī)混合肥配施農(nóng)家肥制度下nirS和nosZ基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜;而深層土壤中施肥制度對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響并不明顯。nirS基因各土壤層次中的優(yōu)勢(shì)片段為75 bp、80 bp和115 bp;而nosZ基因4個(gè)層次不存在共有的優(yōu)勢(shì)片段。nirS基因反硝化細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)片段115bp屬于Magnetospirillum(AB937700),片段75bp屬于Pseudomonas stutzeri(CP011854);nosZ基因反硝化細(xì)菌群落中,0-20 cm 和 20-40 cm層土壤中的優(yōu)勢(shì)片段90 bp和355bp屬于Azospirillum(Rhodospirillales)。而40-60 cm 和 60-90 cm 中的優(yōu)勢(shì)片段 300 bp 屬于 Bradyrhizobium(Rhizobiales)。根據(jù)nosZ基因克隆產(chǎn)物的酶切圖譜,對(duì)酶切類型不同的克隆產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序�？寺⌒蛄斜葘�(duì)相似的可培養(yǎng)菌株菌均屬于變形菌門,且α-變形門細(xì)菌占主導(dǎo)地位。(5)利用典范對(duì)應(yīng)分析或冗余分析對(duì)反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:pH(p0.05)和NH4+-N(p0.05)是影響石灰性紫色水稻土nir 基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子,土壤有機(jī)質(zhì)、總氮還有pH值是影響石灰性紫色水稻土nosZ基因群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子(p0.05)�？傮w而言,長期定位施肥對(duì)石灰性紫色水稻土反硝化酶活和功能(nirS和nosZ)基因反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度及其垂直分布的影響不同。無機(jī)肥更促進(jìn)反硝化酶活。表層土(0-20cm)是nirS和nosZ基因主要存在層次,且群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出與其他層次明顯地差異。無機(jī)肥配施農(nóng)家肥明顯提高nosZ基因拷貝數(shù)和群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜度,而施肥制度對(duì)nirS基因的拷貝數(shù)影響較小。nirS基因反硝化細(xì)菌均屬于變形菌門,且β-變形菌門占主導(dǎo)地位;nosZ基因反硝化細(xì)菌均屬于變形菌門,但α-變形菌門占主導(dǎo)地位。除此之外,影響兩個(gè)功能基因群落結(jié)構(gòu)的最主要環(huán)境因子是土壤pH值。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S151.9
【圖文】：

１．２反硝化過程相關(guān)功能基因及其研究現(xiàn)狀逡逑因?yàn)樽匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)中反硝化微生物多數(shù)是不可培養(yǎng)，且種類繁多，致使長逡逑期以來對(duì)反硝化細(xì)菌的研究不夠深入和系統(tǒng)。近年來，分子生物技術(shù)的發(fā)展為解逡逑決這一問題提供了契機(jī)，但僅采用常規(guī)的１６ＳｒＲＮＡ測(cè)序的方法研宄反硝化細(xì)菌逡逑也存在著極大困難。因?yàn)榧河醒绣潮砻�，反硝化�?xì)菌不能按照傳統(tǒng)的分類學(xué)方法逡逑劃分為某些特定種群，即脫氮顯型不能從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化推斷。與相對(duì)保守的１６Ｓ逡逑ｒＲＮＡ相比，功能基因具有更多的序列變化，利用功能基因可以區(qū)分生態(tài)功能不逡逑同但親源相近的微生物種群，但更重要的是利用功能基因可以鑒定生態(tài)功能相同逡逑但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的微生物種群，如反硝化細(xì)菌。逡逑反硝化過程由以下四個(gè)步驟組成，分別由硝酸還原酶Ｎａｒ、亞硝酸鹽還原酶逡逑Ｎｉｒ、一氧化氮還原酶Ｎｏｒ和一氧化亞l#還原酶Ｎｏｓ催化，如圖１所示。逡逑Ｎａｒ邐Ｃｄ－Ｎｉｒ邐Ｎｏｒ邐Ｎｏｓ逡逑

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本文編號(hào)：2740174