發(fā)布時(shí)間：2020-09-19 08:06

　　 嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus.ferrooxidans,簡稱 A.ferrooxidans),是極端嗜酸的革蘭氏陰性化能自養(yǎng)菌,屬γ-變形桿菌,通過氧化二價(jià)鐵或還原性硫化物獲得能量,通過固定CO2獲得主要碳源。該菌在生物冶金、生物脫硫等工業(yè)應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)證明,A.ferrooxidans生長緩慢,僅能利用少量的外源有機(jī)質(zhì),究其原因,則是該菌具有不完整的中心碳代謝途徑。本文主要選擇中心碳代謝模型中幾個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了以下幾方面的研究,以深入了解該菌的碳代謝途徑。山于A.ferrooxdans中糖酵解途徑中磷酸果糖激酶的活性較低只有E.coli K12 PFK活性的千分之一,采用實(shí)驗(yàn)室建立的無標(biāo)記基因敲除/置換方法,將K12高活性的pfkA基因成功替換到A.ferrooxidans 的pfkB(AFE_1807)的位置,構(gòu)建了 替換突變株A.ferrooxidansR 12 A。與實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pfkB基因敲除突變株A ferrooxidans△1807和用E.coli K12 pB基因替換自身pfkB基因突變株A.ferrooxidansRK12B 一起,以A.ferrooxidansATCC 23270野生型作對照菌株,對新構(gòu)建的替換突變株A.ferrooxidansRK12A進(jìn)行了比較研究,分別以鐵、硫粉為能源時(shí)的細(xì)菌生長特性、葡萄糖的利用能力以及碳代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示:以亞鐵為能源時(shí),pfkB基因的敲除與置換都不影響該菌的亞鐵氧化能力,葡萄糖利用能力變化不大,說明由于在亞鐵培養(yǎng)基中葡萄糖的利用非常有限,即使替換了大腸桿菌高活性pfkA基因的突變株RK12A的葡萄糖利用能力也沒有明顯改變;以硫粉為能源時(shí),置換突變株RK12A和RK12B的細(xì)胞濃度、細(xì)胞干重、粗酶液的PFK比活和葡萄糖的利用能力都比野生型和敲除突變株△1807高,尤其是本文構(gòu)建的用大腸桿菌pfkA基因替換的突變株RK12A優(yōu)勢比較明顯,說明較高活性的pfkA基因替換后促進(jìn)了該菌以硫粉為能源的生長和葡萄糖的利用。A.ferrooxidans ATCC 23270中有兩個(gè)預(yù)測的基因編碼磷酸轉(zhuǎn)酮酶,分別是AFE_1667和AFE_2053,首先經(jīng)蛋白序列比對,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均含有轉(zhuǎn)酮酶保守序列和磷酸轉(zhuǎn)酮酶C端保守序列。其次,通過構(gòu)建AFE_1667和AFE_2053的表達(dá)體系,在大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行了表達(dá),從細(xì)胞粗酶液中檢測到以6-磷酸果糖為底物的磷酸轉(zhuǎn)酮酶酶活,證實(shí)了A.ferrooxidans中具有磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑。第三,以廣泛宿主質(zhì)粒pJRD215為載體,構(gòu)建了兩基因分別過表達(dá)的菌株A.ferrooxidans(pJRD215-1667)和A.ferrooxidans(pJRD215-2053),檢測了以硫粉為能源時(shí),菌株的磷酸轉(zhuǎn)酮酶酶活、少長曲線及碳代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示:兩株過表達(dá)菌株都獲得了更高的磷酸轉(zhuǎn)酮酶,但是沒有表現(xiàn)出生長優(yōu)勢,A.ferrooxidans(pJRD215-1667)反而比野生型對照菌株生長更弱,添加了葡萄糖培養(yǎng)后,菌株的生長都比不添加的有所提高;轉(zhuǎn)錄水平方面,兩個(gè)基因的過表達(dá),使pg/、lk、zwf和pfk都有所上調(diào),說明在一定程度上促進(jìn)了碳代謝途徑的運(yùn)轉(zhuǎn)。AFE_1667過表達(dá)后xfp2上調(diào)表達(dá),添加葡萄糖培養(yǎng)的AFE_2053過表達(dá)后xfpl有輕微的下調(diào)表達(dá),推測XFP1只能以果糖-6-磷酸為底物,XFP2具有雙底物的催化功能,即果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸。A.ferrooxidans具有完整的磷酸戊糖途徑,為了驗(yàn)證該菌是否經(jīng)過該途徑代謝葡萄糖,對該途徑的關(guān)鍵酶基因pgd AFE_2024)和zwf(AFE_2025)進(jìn)行了過表達(dá)研究。首先將共轉(zhuǎn)錄的這兩個(gè)基因克隆至pJ RD215上,導(dǎo)入A.ferrooxidans中獲得工程菌A.ferroxidans(pJRD215-2024-2025),以硫粉為能源,檢測了工程菌的生長及碳代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平。不添加葡萄糖時(shí),工程菌比對照菌株生長弱,添加了 1 g/L的葡萄糖后,工程菌的生長比對照菌略有提高。基因過表達(dá)后,糖酵解途徑的glk上調(diào)表達(dá),pgi明顯下調(diào),意味著生成的葡萄糖-6-磷酸流向糖酵解途徑的量減少,史多流向了HMP途徑;磷酸轉(zhuǎn)酮酶基因xfp-2發(fā)生了上調(diào)表達(dá),而xfp1有輕微下調(diào),推測HMP途徑產(chǎn)生大約等量的木酮糖-5-磷酸和果糖-6-磷酸,刺激了具有雙底物功能的XFP-2上調(diào)表達(dá),僅能催化果糖-6-磷酸的XFP-1下調(diào)表達(dá)。研究比較了葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖和果糖對A.ferrooxidans生長的影響,其中蔗糖與葡萄糖促進(jìn)作用較為顯著,又設(shè)置了蔗糖濃度梯度,探究不同濃度的蔗糖對A.ferrooxidans生長的影響,結(jié)果顯示蔗糖濃度低于4%時(shí),菌株的生長量和對蔗糖的利用隨著濃度的升高而提高,高于4%后都會(huì)下降。由于酸性條件下蔗糖的降解,推測該菌主要通過代謝葡萄糖和果糖消耗蔗糖。研究發(fā)現(xiàn)1%蔗糖培養(yǎng)的細(xì)菌中參與蔗糖水解產(chǎn)物葡萄糖和果糖代謝相關(guān)基因上調(diào)表達(dá),如HMP途徑的關(guān)鍵基因zwf,EMP途徑的pfkB,TCA循環(huán)的pdhA、citz,,而glgA、fbp的上調(diào)表達(dá)說明促進(jìn)了糖原合成。但pgi、glk、xfpl基因下調(diào)表達(dá),推測可能果糖快速生成的1,6-二磷酸果糖不斷積累對葡萄糖的EMP途徑有反饋抑制,更多流向了 HMP途徑。此外,以β-葡萄糖苷酸酶基因(gusA)為報(bào)告基因,構(gòu)建了含在Ptac啟動(dòng)子下四種不同起始密碼子gusA基因的重組質(zhì)粒,分別比較了不同起始密碼了 ATG、TTG、GTG和CTG的gusA基因在大腸桿菌和A.ferrooxidans中表達(dá)的酶活性。結(jié)果顯示,與大腸桿菌一樣,在A.ferrooxidans中,以硫粉或亞鐵為能源時(shí),起始密碼子的強(qiáng)弱順序均為ATGTTGGTGCTG,因此,除了啟動(dòng)子外,可以利用不同起始密碼子的翻譯水平,控制基因在A.ferrooxidans中的表達(dá),為調(diào)控外源基因在A.ferrooxidans中表達(dá)的強(qiáng)弱提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q935;TF18
【部分圖文】：

．３．４二氧化碳固定機(jī)制．作為一種化能自養(yǎng)型細(xì)菌，嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌通過固定空氣中獲取碳源。在４邋．／＾ｒｏｏｘ／而ｒａＡＴＣＣ２３２７０基因組上發(fā)現(xiàn)了二氧化碳固定因，主要分布在五個(gè)基因簇上，分別編碼兩個(gè)拷貝的Ｉ型Ｒｕｂｉｓｃｏ復(fù)合物貝的ｎ型Ｒｕｂｉｓｃｏ復(fù)合物、濃縮二氧化碳的羧化體復(fù)合物以及多個(gè)中間物酶等（ＶａｌｃＭｓ邋ｅｒａ／．，２００８ｂ）。邐．逡逑Ｅｓｐａｒｚａ等通過ＥＭＳＡ實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ａ邐基因組中轉(zhuǎn)錄因子Ｃｂ合八ｃ抑２和的啟動(dòng)子上游區(qū)域，但是不能結(jié)合到上游，囟細(xì)胞中調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，可能與＜：０２濃度有關(guān)（Ｅｓｐａｒｚａ邋ｗｏ／．，邋２０１０）縱子含有ｃ？況在（：０２濃度低時(shí)發(fā)揮作用，因?yàn)轸让阁w能濃縮ＣｕｂｉｓＣＯ的催化能力（Ｐｒｉｃｅ邋Ｗ邋ａ／．，邋２００８；邋Ｓｈｉｖｅｌｙ邋ｄ邋0／．，邋１９９８）邋；邋ｃ從２操縱相＜９，高濃度Ｃ０２時(shí)發(fā)揮作用（ＴｏｙｏｄａｄＷ．，２００５）邋；邋ｃＺ＞Ｗ含有ＣＢＢ

０．２５邋Ｉ逡逑０邋１逡逑圖２．丨重組質(zhì)粒ｐＵＣ１９－ｐＡｒ酶切驗(yàn)證圖譜逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ．逡逑Ｌａｎｅ邋１：邋ｐＵＣ１９；邋Ｌａｎｅ邋２：邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ；邋Ｌａｎｅ邋３：邋ｐＵＣ１９－ｐＡｒ（Ａ７？ａＩ）；邋Ｌａｎｅ邋４：邋ｐＡｒ（Ａ？？ａＩ）；邋Ｌａｎｅ５：逡逑ｐＵＣ邋１９（＾７？＾１）；邋Ｌａｎｅ邋Ｍ：邋Ｔｒａｎｓ２Ｋ邋ＰｌｕｓＩＩ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋ｗｉｔｈ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅｌｅｆｔ邋ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｓｉｚｅｓ逡逑ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．逡逑為了進(jìn)一步驗(yàn)證克隆的；ｒ邋（／Ｖ－／＃木ｒｎｉ５７７邋）單元表達(dá)的蛋白是否具有ＰＦＫ逡逑活性，將重組質(zhì)粒ｐＵＣ１９－ＰＡｒ和ｐＵＣ１９空載體分別轉(zhuǎn)入磷酸果糖激酶缺陷型菌株逡逑￡．邋ｆ0＂ＤＦ１０１０中。以ｆｃｏ／／Ｋ１２作為正對照，以ＤＦ１０１０為負(fù)對照，在Ｍ６３！甘露逡逑醇平板上劃線培養(yǎng)。菌落生長結(jié)果（如圖２．２所示）顯示￡．邋ｃｏ／／邋ＤＦ１０１０和￡．邋ｃ0／／逡逑ＤＦ１０１０邋（ｐＵＣ１９）不能生長，而五．ｃｏ／／邋Ｋ１２和￡．邋ｃｏ＂邋ＤＦ１０１０（ｐＵＣ１９－ｐＡｒ）均能長出逡逑較大菌落，表明ｐＵＣ１９－ｐＡｒ所編碼的蛋白產(chǎn)物具有ＰＦＫ活性。逡逑Ｌ邋＾，０＼ｊ逡逑圖２．２￡．0５／／１＜：１２

ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ質(zhì)粒，再用引物對ＳＭＦ／ＳＭＲ擴(kuò)增質(zhì)粒ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ上的鏈霉素抗逡逑性基因片段進(jìn)行？0１磕證，以野生型左／階0（？油似八丁（：０邋２３２７０為陰性對１＾，質(zhì)逡逑粒ｐＭＳＤｌ－１－ＳｃｅＩ為正對照。結(jié)果如圖２．９所示，正對照質(zhì)粒可以擴(kuò)增出約７００邋ｂｐ逡逑的Ｓｍ片段，而突變株ＲＫ１２Ａ和野生型菌株都沒有，說明質(zhì)粒丟失成功。逡逑ＢＨ｜逡逑０．７５逡逑圖２．９邋ｐＭＳＤｌ－Ｉ－Ｓｃｅ丨質(zhì)粒丟失驗(yàn)證逡逑Ｆｉｇ．邋２．９邋ＰＣＲ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＭＳＤｌ－Ｉ－Ｓｃｅｌｌｏｓｔ邋ｆｒｏｍ邋ＲＫ１２Ａ．邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋Ｓｍ逡逑ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｐａｉｒｓ邋ＳＭＦ／ＳＭＲ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｔｅｍｐｌａｔｅ邋ｏｆ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｆｒｏｍ邋Ａ．逡逑ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ邋ＡＴＣＣ邋２３２７０邋（Ｌａｎｅ邋１）

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