【摘要】：生物冶金技術(shù)是利用自然界的微生物對礦石進(jìn)行生物氧化,在其自身的代謝作用下加速礦石中的金屬礦物轉(zhuǎn)化成金屬氧化物的技術(shù),又稱為生物浸出技術(shù)。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,簡稱A.ferrooxidans)是生物冶金中的優(yōu)勢菌種,是一種重要的冶金工業(yè)微生物。該菌既能以亞鐵離子作為唯一生長能源,又能以單質(zhì)硫或還原性無機(jī)硫化物獲得能量和還原力用于自身的代謝,其能量代謝途徑具有多樣性和復(fù)雜性。深入探究該菌的遺傳背景及其能量代謝系統(tǒng),不僅能在理論上闡明亞鐵代謝和硫代謝的關(guān)系,也能促進(jìn)該菌在生物冶金中的利用效率。關(guān)于A.ferrooxidans的亞鐵氧化代謝機(jī)制尚不明確,由Bonnefoy等人基于模式菌株A.ferrooxidans ATCC 23270提出的亞鐵氧化電子傳遞模型,目前在國際上被普遍接受�；谠搧嗚F氧化電子傳遞模型,Cyc2是唯一的第一個電子受體蛋白,實(shí)驗室前期敲除了cyc2基因及其替代基因AFE_1428,并沒有阻斷亞鐵氧化能力。在此基礎(chǔ)上,為了提高A.ferrooxidans的亞鐵氧化效率,本文從嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌高效啟動子的篩選和亞鐵氧化相關(guān)基因敲除突變株的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析兩個方面展開研究,進(jìn)行了以下工作。將A.ferrooxidans的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測,在全基因組范圍內(nèi)尋找可能的高效啟動子序列,重點(diǎn)分析亞鐵代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和啟動子活性,為在A.ferrooxidans中基因的高效表達(dá)提供備選的啟動子序列。將生物信息學(xué)預(yù)測的11個轉(zhuǎn)錄水平較高基因的啟動子分別與報告基因gusA連接,在大腸桿菌中異源表達(dá)檢測啟動子活性。11個檢測的A.ferrooxidans啟動子在大腸桿菌中的活性6個比Ptac強(qiáng),2個比Ptac弱一些,依次為P0781P2727P1658P2254P2026P2278PtacP0422P2998,剩下3個(P0041、P0696和P1636)啟動子的活性非常低,尚待確認(rèn)。進(jìn)一步將這三個啟動子和兩個有活性的啟動子(P2026和P2998)一起在A.ferrooxidans中檢測活性,結(jié)果是1個比Ptac強(qiáng),2個比Ptac弱一些,依次為P2026PtacP2998P0041,P0041在A.ferrooxidans中具有明顯的啟動子活性,但是P0696和P1636這兩個啟動子同樣幾乎沒有活性,啟動子檢測結(jié)果與在大腸桿菌中相似,分析這些轉(zhuǎn)錄活性較高基因啟動子的活性有較大差異的原因可能是因為啟動子受不同程度的表達(dá)調(diào)控和啟動子預(yù)測軟件的準(zhǔn)確率問題等。高效啟動子的獲得,有利于構(gòu)建亞鐵氧化代謝能力提高的浸礦工程菌。為進(jìn)一步研究嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌亞鐵氧化關(guān)鍵基因cyc2、AFE_1428的功能及其他功能替代基因,以實(shí)驗室在前期工作中獲得的A.ferrooxidans基因敲除突變株△cyc2、△AFE_1428和△cyc2-△AFE_1428為實(shí)驗材料,以AA ferrooxidans ATCC 23270野生型為對照,通過檢測分別以亞鐵和硫粉為能源培養(yǎng)時的生長和亞鐵氧化,分析確定了收集菌體的培養(yǎng)時期,準(zhǔn)備樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。通過分析比較各敲除突變菌株與野生型菌株在以亞鐵為能源培養(yǎng)條件下相關(guān)基因的表達(dá)變化,找出了顯著差異表達(dá)的基因,進(jìn)一步對這些基因進(jìn)行了Pathway和GO功能分析,并用RT-qPCR方法檢測了A.ferrooxidans 亞鐵氧化代謝相關(guān)基因和以上顯著差異表達(dá)的基因的表達(dá)量,驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。最后,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、RT-qPCR結(jié)果和生物信息學(xué)預(yù)測,分析了cyc2、AFE_1428和幾個顯著差異表達(dá)基因在A.ferrooxidans亞鐵氧化代謝中的功能,可通過下一步實(shí)驗進(jìn)一步驗證。綜上,A.ferrooxidans高效啟動子的獲得和亞鐵氧化相關(guān)基因敲除突變株的轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析,為進(jìn)一步研究該菌的亞鐵氧化電子傳遞模型以及其他亞鐵氧化電子關(guān)鍵傳遞體蛋白提供了思路和數(shù)據(jù)支持。
【圖文】：

逡逑圖１．２。然而經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，，Ａ／ｅｒｒａａｘ／而ｍＡＴＣＣ２３２７０基因組中并沒逡逑有ＳＤＯ的編碼基因。隨后Ｑｕａｔｒｉｎｉ等人推測，可能是異二硫化物還原酶復(fù)合物逡逑ＨｄｒＡＢＣ在單質(zhì)硫最初氧化過程中起作用（Ｑｕａｔｒｉｎｉｄａ／．，２００９），如圖１．１。但是逡逑該途徑很不確定，相關(guān)基因的編碼功能也僅基于生物信息學(xué)分析，缺少實(shí)驗證據(jù)。逡逑本實(shí)驗室，在基因組中找到ＳＤＯ的一個潛在的編碼基因ＡＦＥ＿０２６９，并通過基逡逑因克隆和在大腸桿菌中異源表達(dá)，證實(shí)ＡＦＥ＿０２６９基因的編碼產(chǎn)物具有ＳＤＯ活逡逑性，但進(jìn)一步對該基因在Ａ聲／ｒｏｏｘ／Ｗｏｒａ中將基因敲除和過表達(dá)，結(jié)果顯示ＳＤＯ逡逑酶的功能可能與細(xì)胞內(nèi)硫化物的解毒更相關(guān)

Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｍｏｄｅｌ邋ｏｆＦｅ２＋邋ｏｘｉｄａｔｉｏｎ邋＼ｎ邋Ａ．邋ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ邋ＡＴＣＣ邋２３２７０邋（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ邋ａｎｄ逡逑Ｈｏｌｍｅｓ，邋２０１２）．逡逑由圖１．３可以看出，Ｆｅ２＋氧化產(chǎn)生的電子是以“順電勢”梯度和“逆電勢”梯度逡逑兩條電子傳遞途徑進(jìn)行的。“順電勢”梯度電子傳遞途徑為：Ｆｅ２＋—細(xì)胞色素蛋白逡逑Ｃｙｃ２－＞銅藍(lán)蛋白Ｒｕｓ—細(xì)胞色素蛋白Ｃｙｃｌ—細(xì)胞色素氧化酶0２，；邋“逆電勢”逡逑梯度電子傳遞途徑為：Ｆｅ２＋—細(xì)胞色素蛋白Ｃｙｃ２—銅藍(lán)蛋白Ｒｕｓ—細(xì)胞色素蛋白逡逑ＣｙｃＡｌ—細(xì)胞色素復(fù)合體—醌池—ＮＡＤＨ－Ｑ還原酶—ＮＡＤ＋。根據(jù)電子傳遞逡逑鏈中各傳遞體氧化還原電位的研宄結(jié)果顯示，也支持該模型（Ｂｉｒｄ以《／．，２０１１）。逡逑其中，Ｆｅ２＋氧化產(chǎn)生的電子大部分沿“順電勢”梯度電子傳遞途徑，從外膜進(jìn)入到逡逑細(xì)胞質(zhì)中，最終傳遞給0２，并與質(zhì)子結(jié)合生成Ｈ２０。只有大約５％的電子經(jīng)由“逆逡逑電勢”梯度電子傳遞途徑，在ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ還原酶的作用下使ＮＡＤ（Ｐ）邋＋還原為逡逑ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ，生成細(xì)胞固定Ｃ０２和參與有氧代謝所需的還原力。逡逑在該模型中，編碼與Ｆｅ２＋氧化相關(guān)電子傳遞體蛋白的基因主逡逑要存在于兩個轉(zhuǎn)錄單元中。在“順電勢”梯度電子傳遞鏈中
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TF18;Q78

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本文編號：2682148