DUF647（Domain of Unknown Function 647,DUF647）蛋白家族是在真核生物,包括動(dòng)物、植物和一些真菌中廣泛存在的一個(gè)蛋白家族。在擬南芥中,編碼DUF647蛋白的基因一共有6個(gè),分別是RUS1（At3g45890）、RUS2（At2g31190）、RUS3（At1g13770）、RUS4（At2g23470）、RUS5（At5g01510）和RUS6（At5g49820）。然而,到目前為止,只有RUS1和RUS2的功能已有研究,它們共同參與根感知UV-B信號途徑,其余4個(gè)RUS基因的功能未見報(bào)道。本論文以人工microRNA（artificial microRNA,amiRNA）特異沉默RUS4的轉(zhuǎn)基因擬南芥（稱為amiR-rus4）為材料,對RUS4基因在花藥開裂和花粉發(fā)育中的作用進(jìn)行了比較祥盡的研究,取得了以下結(jié)果:1、RUS4敲減導(dǎo)致花藥不能開裂qPCR分析發(fā)現(xiàn),RUS4在amiR-rus4花蕾中的表達(dá)量顯著下降,RUS4的敲減導(dǎo)致育性大幅降低。相互雜交實(shí)驗(yàn)表明,amiR-rus4株系的雌蕊正常,雄蕊的發(fā)育存在缺陷。通過掃描電鏡和半薄切片技術(shù)進(jìn)一步...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 模式植物擬南芥
    1.2 擬南芥RUS基因的研究進(jìn)展
        1.2.1 擬南芥RUS基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 擬南芥RUS基因的功能
    1.3 雄蕊發(fā)育
        1.3.1 雄蕊特化
        1.3.2 花藥發(fā)育
        1.3.3 花藥開裂
    1.4 花粉發(fā)育
        1.4.1 小孢子發(fā)生
        1.4.2 雄配子發(fā)生
    1.5 花粉粒中主要的脂類結(jié)構(gòu)與功能
        1.5.1 孢粉素
        1.5.2 花粉被
        1.5.3 花粉細(xì)胞內(nèi)油體
        1.5.4 內(nèi)膜系統(tǒng)
    1.6 本研究的背景及意義
第二章 RUS4敲減導(dǎo)致花藥不能開裂
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 常用溶液和培養(yǎng)基配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 擬南芥的種植
        2.2.2 花藥整體透明
        2.2.3 花藥的溴化乙錠和吖啶橙染色
        2.2.4 掃描電鏡
        2.2.5 半薄切片
        2.2.6 總RNA提取
        2.2.7 反轉(zhuǎn)錄
        2.2.8 熒光定量PCR
        2.2.9 半定量PCR
        2.2.10 35S_pro:RUS4過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥
        2.2.11 轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 表型分析
        2.3.2 amiR-rus4雄蕊發(fā)育存在異常
        2.3.3 amiR-rus4花藥不能正常開裂
        2.3.4 amiR-rus4花藥的藥室內(nèi)壁缺少次生加厚
        2.3.5 與藥室內(nèi)壁次生加厚相關(guān)基因在amiR-rus4花蕾中的表達(dá)降低
        2.3.6 RUS4過表達(dá)可以互補(bǔ)amiR-rus4株系表型
        2.3.7 RUS4過表達(dá)引起NST1和NST2不同程度的變化
        2.3.8 RUS4過表達(dá)特異性地引起雄蕊次生加厚增強(qiáng),但不會(huì)誘發(fā)其它組織的異位次生加厚
    2.4 討論
第三章 RUS4敲減影響花粉發(fā)育
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 常用溶液和培養(yǎng)基配方
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 亞歷山大染色
        3.2.2 花粉體外萌發(fā)
        3.2.3 苯胺藍(lán)染色
        3.2.4 花粉的DPBA和 Nile Red染色
        3.2.5 掃描電鏡
        3.2.6 透射電鏡
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 amiR-rus4花粉活力下降
        3.3.2 amiR-rus4 花粉萌發(fā)率降低,花粉管長度變短
        3.3.3 amiR-rus4花粉嚴(yán)重變形
        3.3.4 amiR-rus4花粉被的形成遭到破壞
    3.4 討論
第四章 RUS4表達(dá)模式
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 分離原生質(zhì)體所用到的溶液
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 擬南芥的種植
        4.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 RUS4_pro:GUS表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥
        4.2.4 35S_pro:RUS4-GFP過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥
        4.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定
        4.2.6 GUS染色
        4.2.7 原生質(zhì)體的分離
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 RUS4在不同組織中均有表達(dá)
        4.3.2 RUS4在花藥中高表達(dá)
        4.3.3 RUS4在花粉外壁和花粉被中表達(dá)
        4.3.4 RUS4定位在葉綠體
    4.4 討論
總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡介及聯(lián)系方式



本文編號：4039263