牛乳鐵蛋白（LfcinB）是一種陽離子抗菌肽,具有抗細(xì)菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性.本文探討了利用SUMO（Small Ubiquitin-Related Modifier）融合標(biāo)簽在大腸桿菌系統(tǒng)中通過LfcinB串聯(lián)表達(dá)策略制備重組LfcinB的方法.結(jié)果顯示,大于90%的SUMO-（LfcinB）_n蛋白以可溶形式表達(dá)于BL21（DE3）細(xì)胞中;SUMO-（LfcinB）₂的表達(dá)量高于SUMO-LfcinB和SUMO-（LfcinB）₃.通過SUMO特異性蛋白酶切除SUMO標(biāo)簽,羥胺釋放單體,得到純化的重組LfcinB,產(chǎn)率約為15 mg/L.生物活性結(jié)果表明,重組LfcinB具有一定的抗菌和抗腫瘤活性.本研究為結(jié)合SUMO標(biāo)簽與串聯(lián)表達(dá)策略大量制備獲得具有生物學(xué)功能的重組抗菌肽提供了一種有效的方法.

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圖2 重組表達(dá)菌生長(zhǎng)曲線及重組蛋白表達(dá)分析

為提高抗菌肽的表達(dá)產(chǎn)量,通常采用串聯(lián)多聚體形式來代替單體形式進(jìn)行抗菌肽的融合表達(dá)[9,13].pSUMO是本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的一個(gè)帶有SUMO標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒,具有BamHⅠ、XbaⅠ、BglⅡ等多克隆酶切位點(diǎn).將擴(kuò)增得到的LfcinB基因片段和pSUMO經(jīng)BamHⅠ和Hin....

圖1 pSUMO-(LfcinB)n表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2重組表達(dá)菌生長(zhǎng)曲線及重組蛋白表達(dá)分析2.2SUMO-(LfcinB)n重組蛋白的表達(dá)

圖3 SUMO-(LfcinB)n蛋白純化與鑒定的SDS-PAGE分析

由于抗菌肽自身的抗菌性,通常采用融合表達(dá)策略以降低潛在的宿主細(xì)胞毒性.然而,并非所有的融合標(biāo)簽都能有效避免宿主細(xì)胞毒性,例如GST標(biāo)簽并不能有效避免宿主細(xì)胞毒性[15].本研究發(fā)現(xiàn)SUMO標(biāo)簽融合能在一定程度上避免(LfcinB)n宿主細(xì)胞毒性,并且影響的程度與串聯(lián)拷貝數(shù)有關(guān)....

圖5 重組LfcinB對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌檢測(cè)

經(jīng)親和層析純化得到的SUMO-(LfcinB)n融合蛋白用SUMO酶在30℃酶切30min,以釋放抗菌肽(LfcinB)n.Tricine-SDS-PAGE測(cè)定SUMO酶的酶切作用,結(jié)果如圖4所示.可見SUMO酶能高效切割SUMO-(LfcinB)n融合蛋白,釋放(Lf....

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