動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的主要發(fā)病原因。大量研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化的形成與內(nèi)皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛相關(guān)。探討內(nèi)皮細(xì)胞中的初級(jí)纖毛裝配和解聚的機(jī)制,對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前,作為平面細(xì)胞極化(PCP)信號(hào)通路的特有組分VANGL平面細(xì)胞極性蛋白2(VANGL2)在內(nèi)皮細(xì)胞中與初級(jí)纖毛相關(guān)的研究甚少。因此,本研究構(gòu)建VANGL2的慢病毒穩(wěn)定干擾和過(guò)表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(hUVEC)系。從形態(tài)學(xué)上對(duì)初級(jí)纖毛分布的情況進(jìn)行標(biāo)記,同時(shí)用免疫熒光對(duì)VANGL2可能相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行共定位檢測(cè),并利用免疫印跡進(jìn)一步對(duì)其下游蛋白質(zhì)蓬亂蛋白(DVL2)、初級(jí)纖毛裝配相關(guān)蛋白質(zhì)巴特-比德?tīng)柧C合征8(BBS8)和纖毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)88(IFT88)、初級(jí)纖毛解聚相關(guān)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)蛋白家族成員2A(KIF2A)和143位點(diǎn)處絲氨酸磷酸化的蓬亂蛋白(pDVL2)進(jìn)行檢測(cè),用免疫共沉淀檢測(cè)與VANGL2、下游蛋白質(zhì)DVL2相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明,免疫熒光標(biāo)記初級(jí)纖毛的熒光圖顯示,過(guò)表達(dá)VANGL2后初級(jí)纖毛數(shù)量顯著增多(P<0.05),其長(zhǎng)度也較其他組更長(zhǎng),其定位方向更傾向于VA...

【文章頁(yè)數(shù)】：12 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 Vangl2過(guò)表達(dá)和沉默慢病毒顆粒合成
        1.2.1 目的基因人Vangl2編碼序列的擴(kuò)增
        1.2.2 干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和引物合成
        1.2.3 過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)載體的構(gòu)建
        1.2.4 重組慢病毒質(zhì)粒的包裝與轉(zhuǎn)染
        1.2.5 病毒滴度測(cè)定
    1.3 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細(xì)胞系
        1.3.1 慢病毒感染hUVECs細(xì)胞
        1.3.2 Real-time qPCR檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)Vangl2的mRNA表達(dá)水平
        1.3.3 Western印跡檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)VANGL2的效率
    1.4 免疫熒光檢測(cè)初級(jí)纖毛在各組細(xì)胞系中的分布
    1.5 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞系中VANGL2可能相互作用的蛋白質(zhì)共定位
    1.6 過(guò)表達(dá)和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細(xì)胞系中的VANGL2下游蛋白質(zhì)及纖毛相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)及相互作用關(guān)系
        1.6.1 Western印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá)和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細(xì)胞系中的VANGL2下游蛋白質(zhì)及纖毛相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)
        1.6.2 免疫共沉淀檢測(cè)與VANGL2、下游蛋白質(zhì)DVL2相互作用的蛋白質(zhì)
    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法
2 結(jié)果
    2.1 成功構(gòu)建重組過(guò)表達(dá)pHBLV-Vangl2和重組干擾pHB-shRNA-Vangl2慢病毒載體
    2.2 重組過(guò)表達(dá)pHBLV-Vangl2和重組干擾pHB-shRNA-Vangl2慢病毒載體的包裝、轉(zhuǎn)染和滴度測(cè)定
    2.3 成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細(xì)胞系
    2.4 VANGL2能夠促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞中初級(jí)纖毛的發(fā)生和伸長(zhǎng)過(guò)程
    2.5 VANGL2與BBS8、IFT88、PLK1之間可能存在相互作用以調(diào)節(jié)初級(jí)纖毛相關(guān)過(guò)程
    2.6 VANGL2通過(guò)上調(diào)DVL2促進(jìn)纖毛的解聚過(guò)程,同時(shí)通過(guò)下調(diào)pDVL2、上調(diào)BBS8和IFT88增加纖毛的裝配過(guò)程
3 討論



本文編號(hào)：3986908