發(fā)布時間：2024-06-02 05:15

　　動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要發(fā)病原因。大量研究顯示,動脈粥樣硬化的形成與內皮細胞的初級纖毛相關。探討內皮細胞中的初級纖毛裝配和解聚的機制,對于揭示動脈粥樣硬化的發(fā)病機制具有重要的理論和實踐意義。目前,作為平面細胞極化(PCP)信號通路的特有組分VANGL平面細胞極性蛋白2(VANGL2)在內皮細胞中與初級纖毛相關的研究甚少。因此,本研究構建VANGL2的慢病毒穩(wěn)定干擾和過表達人臍靜脈內皮細胞(hUVEC)系。從形態(tài)學上對初級纖毛分布的情況進行標記,同時用免疫熒光對VANGL2可能相互作用的蛋白質進行共定位檢測,并利用免疫印跡進一步對其下游蛋白質蓬亂蛋白(DVL2)、初級纖毛裝配相關蛋白質巴特-比德爾綜合征8(BBS8)和纖毛內轉運系統(tǒng)88(IFT88)、初級纖毛解聚相關蛋白質運動蛋白家族成員2A(KIF2A)和143位點處絲氨酸磷酸化的蓬亂蛋白(pDVL2)進行檢測,用免疫共沉淀檢測與VANGL2、下游蛋白質DVL2相互作用的蛋白質。結果表明,免疫熒光標記初級纖毛的熒光圖顯示,過表達VANGL2后初級纖毛數(shù)量顯著增多(P<0.05),其長度也較其他組更長,其定位方向更傾向于VA...

【文章頁數(shù)】：12 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 Vangl2過表達和沉默慢病毒顆粒合成
        1.2.1 目的基因人Vangl2編碼序列的擴增
        1.2.2 干擾靶點設計和引物合成
        1.2.3 過表達和干擾表達載體的構建
        1.2.4 重組慢病毒質粒的包裝與轉染
        1.2.5 病毒滴度測定
    1.3 構建穩(wěn)定過表達和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細胞系
        1.3.1 慢病毒感染hUVECs細胞
        1.3.2 Real-time qPCR檢測沉默和過表達Vangl2的mRNA表達水平
        1.3.3 Western印跡檢測沉默和過表達VANGL2的效率
    1.4 免疫熒光檢測初級纖毛在各組細胞系中的分布
    1.5 免疫熒光檢測各組細胞系中VANGL2可能相互作用的蛋白質共定位
    1.6 過表達和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細胞系中的VANGL2下游蛋白質及纖毛相關蛋白質的表達及相互作用關系
        1.6.1 Western印跡檢測過表達和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細胞系中的VANGL2下游蛋白質及纖毛相關蛋白質的表達
        1.6.2 免疫共沉淀檢測與VANGL2、下游蛋白質DVL2相互作用的蛋白質
    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
2 結果
    2.1 成功構建重組過表達pHBLV-Vangl2和重組干擾pHB-shRNA-Vangl2慢病毒載體
    2.2 重組過表達pHBLV-Vangl2和重組干擾pHB-shRNA-Vangl2慢病毒載體的包裝、轉染和滴度測定
    2.3 成功構建過表達和干擾VANGL2的穩(wěn)定hUVECs細胞系
    2.4 VANGL2能夠促進人內皮細胞中初級纖毛的發(fā)生和伸長過程
    2.5 VANGL2與BBS8、IFT88、PLK1之間可能存在相互作用以調節(jié)初級纖毛相關過程
    2.6 VANGL2通過上調DVL2促進纖毛的解聚過程,同時通過下調pDVL2、上調BBS8和IFT88增加纖毛的裝配過程
3 討論



本文編號：3986908