目的在大腸桿菌中異源表達和純化人源Parkin蛋白。方法構(gòu)建帶有人源Parkin基因的克隆載體,測序保證Parkin基因序列正確后,構(gòu)建異源表達載體pET-28a/Parkin;在Escherichia coli BL21(DE3)中誘導人源Parkin蛋白過表達,采用鎳親和色譜純化人源Parkin蛋白,用Western印跡(WB)和熒光分光光度法評價人源Parkin蛋白活性。結(jié)果人源Parkin蛋白在E.coli BL21(DE3)中獲高表達,經(jīng)鎳親和色譜純化后除去了大量雜蛋白,得到富集;WB和熒光分光光度法檢測均證實異源表達的人源Parkin蛋白具有生物活性。結(jié)論通過異源表達技術(shù)獲得高純度的且具有生物活性的人源Parkin蛋白,可用于Parkin調(diào)節(jié)劑的快速篩選與研究。

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圖5Parkin蛋白質(zhì)表達

圖4重組質(zhì)粒PCR驗證及菌落PCR驗證圖6Parkin經(jīng)Ni-NTA柱純化后的SDS-PAGE檢測

圖7Western印跡法檢測人源Parkin蛋白活性

圖6Parkin經(jīng)Ni-NTA柱純化后的SDS-PAGE檢測圖8熒光分光光度法檢測人源Parkin蛋白活性

圖8熒光分光光度法檢測人源Parkin蛋白活性

圖7Western印跡法檢測人源Parkin蛋白活性3討論

圖2Parkin基因序列測序結(jié)果

圖1Parkin經(jīng)PCR擴增的凝膠電泳圖圖3重組質(zhì)粒酶切驗證

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