染料脫色過(guò)氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)屬于以血紅素為輔基的新型過(guò)氧化物酶類(lèi),常因缺乏輔因子而導(dǎo)致催化活性低。將來(lái)源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脫色過(guò)氧化物酶基因(TfuDyP)與大腸桿菌谷氨酰-tRNA還原酶基因(hemA),構(gòu)建重組質(zhì)粒phemA-DyP,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中進(jìn)行共表達(dá)。分別以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)和頑固性染料活性藍(lán)19(RB19)、溴酚藍(lán)、溴甲酚綠為底物檢測(cè)TfuDyP的催化活力以及染料脫色效率。結(jié)果表明,誘導(dǎo)后的共表達(dá)菌株pAD胞內(nèi)血紅素含量為9. 8μmol/L,而單獨(dú)過(guò)表達(dá)基因TfuDyP的菌株pD僅為3. 4μmol/L。TfuDyP純酶的全波長(zhǎng)掃描分析表明,在菌株pAD中DyP酶與血紅素的結(jié)合度相比pD有較大幅度的提升。pAD菌株表達(dá)的DyP酶活力較pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脫色應(yīng)用方面也得到增強(qiáng)。在pAD菌株培養(yǎng)基中分別添加谷氨酸(Glu)、FeCl₂使得胞內(nèi)血紅素含量、DyP酶活...

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圖1重組質(zhì)粒phemA-DyP示意圖

用pDyP質(zhì)粒作為模板，利用上游引物5"-AAGCT-TGCGGCCGCACTCGAGTAATACGACTCACTAT-AGGG-GA-3"和下游引物5"-GTGGTGGTGGTGGTGCT-CGAGT-TAACCTTCAATCAGATCCTGACCC-3"擴(kuò)增得到TfuD....

圖2目的基因和重組質(zhì)粒構(gòu)建的凝膠電泳

以實(shí)驗(yàn)室保存的pDyP質(zhì)粒為模板，使用特異性引物PCR擴(kuò)增獲取目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示與預(yù)期大小1543bp相符(圖2-a)。通過(guò)同源重組酶連接到phemA質(zhì)粒上，組成新的重組質(zhì)粒phemA-DyP，用XhoI酶切并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證(圖2-b),phem....

圖3TfuDyP的SDS-PAGE電泳分析

將新構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有活性的可溶性TfuDyP,TfuDyP粗酶液經(jīng)鎳柱純化和脫鹽柱脫鹽處理后，利用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)重組蛋白純度。如圖3所示，酶純度已到達(dá)了酶學(xué)性質(zhì)分析的要求，融合蛋白理論大小約....

圖4重組菌的血紅素含量

將重組菌在37℃、0.3mmol/LIPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行胞內(nèi)血紅素檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，pD菌株血紅素濃度為3.4μmol/L，而共表達(dá)菌株pAD血紅素濃度明顯提高，達(dá)到9.8μmol/L，在菌株pAD培養(yǎng)基中外源添加20μmol/LFeCl2(下同)、40μmol/L谷....

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