目的:基于由環(huán)狀異構(gòu)黃色熒光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有線粒體定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)熒光蛋白構(gòu)建攜帶有rp-mt基因的慢病毒載體,驗(yàn)證其在線粒體鈣檢測(cè)中的功能,為進(jìn)一步研究線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮的作用提供參考依據(jù)。方法:采用慢病毒載體EF-1αF-puro和rp-mt質(zhì)粒構(gòu)建攜帶有rp-mt基因的重組慢病毒載體,經(jīng)脂質(zhì)體法在293T細(xì)胞中與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,收集構(gòu)建好的重組慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并體外感染人肝癌細(xì)胞SNU-739,驗(yàn)證重組慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。結(jié)果:以慢病毒載體EF-1αF-puro為骨架質(zhì)粒,成功構(gòu)建了攜帶有rp-mt基因的重組慢病毒載體(EF-1αF-puro-rp-mt),收集獲得的重組慢病毒滴度為4×10⁶TU/m L。將攜帶有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739細(xì)胞48小時(shí)后,在熒光顯微鏡下觀察到有超過(guò)85%的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,定位于細(xì)胞線粒體內(nèi),且對(duì)SNU-73...

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圖1慢病毒載體圖譜

慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞上清液，濃縮病毒。收集好的病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，在熒光顯微鏡下觀察，能看到熒光的最大稀釋倍數(shù)為105和106稀釋，孔內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)分別為30個(gè)和5個(gè)，因此計(jì)算EF-1αF-puro-rp-mt慢病毒的滴度為4×106TU/....

圖2重組慢病毒酶切體系及RT-PCR結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳

用EF-1cαF-puro-rp-mt慢病毒感染人肝癌細(xì)胞SNU-73948h后，加入經(jīng)HBSS稀釋后的mitotracker染色30min；用PBS洗去細(xì)胞上清液中的染料，于共聚焦顯微鏡綠光和藍(lán)光下觀察，如圖4所示，共定位結(jié)果顯示rp-mt蛋白特異性聚集于線粒體中(圖4C中....

圖3感染重組慢病毒293T細(xì)胞cDNA做模板PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體在細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。線粒體代謝的激活、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、胞質(zhì)Ca2+的調(diào)節(jié)，都依賴于線粒體基質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的動(dòng)態(tài)變化[17,18]。因此，從上個(gè)世紀(jì)五十年代起，就先后建立了各種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的方法，如微電極法、核磁共振法、鈣有機(jī)顯色....

圖4重組慢病毒感染SNU-739細(xì)胞48h熒光結(jié)果

圖3感染重組慢病毒293T細(xì)胞cDNA做模板PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖5Rp-mt與mitotracker共定位結(jié)果

本文編號(hào)：3947987