將γ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(γ-CGTase)的特有區(qū)域作為判斷依據(jù),在美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中,通過序列比對(duì)及生物信息學(xué)分析,篩選出一種新型基因,并將其克隆表達(dá)得到一種酶。利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行產(chǎn)物鑒定,表明該酶為γ-CGTase;酶分子質(zhì)量大約為80 k Da,最適溫度50℃,最適pH 10. 0;無α-環(huán)糊精生成;甲醇、乙醇、環(huán)己烷、十二醇激活γ-CGTase活力,異丙醇和正丁醇抑制γ-CGTase活力;反應(yīng)時(shí)間、淀粉質(zhì)量濃度及乙醇體積分?jǐn)?shù)均會(huì)影響γ-CGTase的產(chǎn)物特異性。HPLC結(jié)果顯示,在10%的乙醇最終體積分?jǐn)?shù)條件下,γ-CGTase催化產(chǎn)物中γ-環(huán)糊精的比例由40. 11%增加至78. 20%,專一性提高了94. 96%。該研究提供了一種新型的γ-CGTase,為提高γ-CGTase產(chǎn)物特異性提供研究基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖2純化后γ-CGTase的SDS-PAGE分析

溫度是影響酶催化作用的一個(gè)重要因素，在最適溫度下，酶催化活性最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速率最大，當(dāng)反應(yīng)溫度高于或低于最適溫度時(shí)，酶活力均會(huì)降低進(jìn)而影響酶促反應(yīng)速率。由圖5可知，γ-CGTase的最適溫度為50℃，與現(xiàn)有報(bào)道的γ-CGTase最適溫度40～65℃接近[22-23]。γ-CGTa....

圖3γ-CGTase產(chǎn)物高效液相色譜圖

圖2純化后γ-CGTase的SDS-PAGE分析圖4γ-CGTase產(chǎn)物的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖

圖4γ-CGTase產(chǎn)物的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖

圖3γ-CGTase產(chǎn)物高效液相色譜圖圖5溫度對(duì)γ-CGTase酶活力的影響

圖1γ-CGTase保守區(qū)域及關(guān)鍵序列分析

采用MEGA6軟件將NCBI數(shù)據(jù)庫中Bacillussp.FJAT-44876的蛋白序列與已知表達(dá)α-CD、β-CD和γ-CD的CGTase序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖1-A所示。來源于Bacillussp.FJAT-44876的蛋白序列共有5個(gè)結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)未體現(xiàn))[17]、6個(gè)保....

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