鹵醇脫鹵酶不僅能夠降解環(huán)境中存在的有機(jī)鹵化物,還能合成具有手性的環(huán)氧化物和β-取代醇,其催化機(jī)理和廣泛的應(yīng)用前景近年來備受關(guān)注。鹵醇脫鹵酶的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化與其生物功能緊密相連,是鹵醇脫鹵酶發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對(duì)其結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)的研究有助于揭示鹵醇脫鹵酶的催化反應(yīng)機(jī)理,以及提升酶的改造效率。眾所周知,光譜技術(shù)在研究酶蛋白結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)性方面具有廣泛應(yīng)用,相關(guān)研究需要在酶蛋白中嵌入合適的光譜探針,因此探針對(duì)酶蛋白的標(biāo)記就顯得尤為重要。本研究結(jié)合了生物學(xué)技術(shù)和光譜技術(shù),將紅外、熒光探針位點(diǎn)特異性的嵌入鹵醇脫鹵酶中,探針標(biāo)記鹵醇脫鹵酶的位點(diǎn)不受局限,對(duì)所處的微環(huán)境非常敏感,且能精準(zhǔn)地反映出酶蛋白動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的微小變化,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)。本研究應(yīng)用密碼子擴(kuò)展法將非天然氨基酸Naek引入HheC的K140,K161,P184三個(gè)位點(diǎn),通過優(yōu)化表達(dá)體系和親和層析得到了疊氮基團(tuán)修飾的酶蛋白,并進(jìn)行了酶催化特性及紅外光譜檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)184⁺突變體的酶活最佳,并且具有與野生型相當(dāng)?shù)臒岱�(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度;(2)由于探針?biāo)幬h(huán)境的極性不同,K140,K161,...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2鹵醇脫鹵酶的脫鹵反應(yīng)流程

通過開環(huán)反應(yīng)合成環(huán)氧化合物及釋放過程中，鹵醇脫鹵酶活性位點(diǎn)的構(gòu)構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和機(jī)制，也能進(jìn)一的脫鹵機(jī)制遵循三步動(dòng)力學(xué)步驟：米氏鹵醇脫鹵酶催化PNSHH的脫鹵反應(yīng)過速步驟。圖1-1鹵醇脫鹵酶的脫鹵反應(yīng)流程[6]生成，速率常數(shù)Ks；第二步：可逆反應(yīng)，常數(shù)k3，此步為限....

圖1-3修飾Cys和Lys殘基的生物共軛反應(yīng)[29]

辨率地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞中的酶動(dòng)力學(xué)。作者使用該方法檢測(cè)了小鼠模胞中NAD（P）H與酶的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)，觀察到復(fù)合I位點(diǎn)的線粒體呼是通過游離和蛋白質(zhì)結(jié)合的重新分布介導(dǎo)的。光譜技術(shù)在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)具有諸多優(yōu)勢(shì)，探針能靈敏地反環(huán)境的信息以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。因此，在保證蛋白質(zhì)....

圖1-4體外將UAA位點(diǎn)特異性嵌入蛋白質(zhì)中[33]

46]，振動(dòng)光譜[47-49]等方法觀察其獨(dú)特的光譜特征。和疊氮化物可以說是UAA最重要的兩個(gè)功能基團(tuán)，因?yàn)樗鼈冊(cè)贗R檢穩(wěn)定，具有比較好的光譜靈敏度和吸收值[50,51]。疊氮化物作為非天然氨較大的優(yōu)越性，因?yàn)榀B氮化合物具有更大的消光系數(shù)，同時(shí)在頻率變化對(duì)其局部環(huán)境的高....

圖1-7光催化環(huán)加成反應(yīng)(Photoclickreaction)

圖1-5疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（SPAAC）[74]他類型的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)化的Huisgen1,3-偶極環(huán)加成[81]將兩種不飽和的反應(yīng)物結(jié)合各種五元雜環(huán)[82]，反應(yīng)過程如圖1-6所示。該反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了涉共軛反應(yīng)（每步產(chǎn)率>99.8％）[83]，并已用于基于活性的蛋[84]....

本文編號(hào)：3923244