發(fā)布時間：2024-03-09 09:50

　　鹵醇脫鹵酶不僅能夠降解環(huán)境中存在的有機鹵化物,還能合成具有手性的環(huán)氧化物和β-取代醇,其催化機理和廣泛的應(yīng)用前景近年來備受關(guān)注。鹵醇脫鹵酶的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化與其生物功能緊密相連,是鹵醇脫鹵酶發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對其結(jié)構(gòu)動力學的研究有助于揭示鹵醇脫鹵酶的催化反應(yīng)機理,以及提升酶的改造效率。眾所周知,光譜技術(shù)在研究酶蛋白結(jié)構(gòu)的動態(tài)性方面具有廣泛應(yīng)用,相關(guān)研究需要在酶蛋白中嵌入合適的光譜探針,因此探針對酶蛋白的標記就顯得尤為重要。本研究結(jié)合了生物學技術(shù)和光譜技術(shù),將紅外、熒光探針位點特異性的嵌入鹵醇脫鹵酶中,探針標記鹵醇脫鹵酶的位點不受局限,對所處的微環(huán)境非常敏感,且能精準地反映出酶蛋白動態(tài)結(jié)構(gòu)的微小變化,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動力學研究中具有顯著優(yōu)勢。本研究應(yīng)用密碼子擴展法將非天然氨基酸Naek引入HheC的K140,K161,P184三個位點,通過優(yōu)化表達體系和親和層析得到了疊氮基團修飾的酶蛋白,并進行了酶催化特性及紅外光譜檢測。實驗結(jié)果表明:(1)184⁺突變體的酶活最佳,并且具有與野生型相當?shù)臒岱�(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度;(2)由于探針所處微環(huán)境的極性不同,K140,K161,...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-2鹵醇脫鹵酶的脫鹵反應(yīng)流程

通過開環(huán)反應(yīng)合成環(huán)氧化合物及釋放過程中，鹵醇脫鹵酶活性位點的構(gòu)構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和機制，也能進一的脫鹵機制遵循三步動力學步驟：米氏鹵醇脫鹵酶催化PNSHH的脫鹵反應(yīng)過速步驟。圖1-1鹵醇脫鹵酶的脫鹵反應(yīng)流程[6]生成，速率常數(shù)Ks；第二步：可逆反應(yīng)，常數(shù)k3，此步為限....

圖1-3修飾Cys和Lys殘基的生物共軛反應(yīng)[29]

辨率地實時監(jiān)測單細胞中的酶動力學。作者使用該方法檢測了小鼠模胞中NAD（P）H與酶的實時動力學，觀察到復合I位點的線粒體呼是通過游離和蛋白質(zhì)結(jié)合的重新分布介導的。光譜技術(shù)在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)動力學具有諸多優(yōu)勢，探針能靈敏地反環(huán)境的信息以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。因此，在保證蛋白質(zhì)....

圖1-4體外將UAA位點特異性嵌入蛋白質(zhì)中[33]

46]，振動光譜[47-49]等方法觀察其獨特的光譜特征。和疊氮化物可以說是UAA最重要的兩個功能基團，因為它們在IR檢穩(wěn)定，具有比較好的光譜靈敏度和吸收值[50,51]。疊氮化物作為非天然氨較大的優(yōu)越性，因為疊氮化合物具有更大的消光系數(shù)，同時在頻率變化對其局部環(huán)境的高....

圖1-7光催化環(huán)加成反應(yīng)(Photoclickreaction)

圖1-5疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（SPAAC）[74]他類型的點擊化學反應(yīng)化的Huisgen1,3-偶極環(huán)加成[81]將兩種不飽和的反應(yīng)物結(jié)合各種五元雜環(huán)[82]，反應(yīng)過程如圖1-6所示。該反應(yīng)實現(xiàn)了涉共軛反應(yīng)（每步產(chǎn)率>99.8％）[83]，并已用于基于活性的蛋[84]....

本文編號：3923244