考察了環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monphosphate,cAMP)生產(chǎn)酵母菌株G2在YPD培養(yǎng)基中不同生長(zhǎng)階段的總RNA提取效果,并進(jìn)行了初步改進(jìn)研究。選擇16 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、36 h二次生長(zhǎng)期和60 h穩(wěn)定期細(xì)胞,分別用試劑盒提取,RNA得率依次為1 010.6、171.5和91.3 ng/A600。選擇高、低豐度表達(dá)基因ACT1和CYR1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRTPCR),同時(shí)判斷DNA污染情況;瓊脂糖電泳和RNA完整值(RNA integrity number,RIN)測(cè)定判斷完整性。結(jié)果顯示,36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染,僅16 h樣品能滿足RNA測(cè)序要求。進(jìn)一步對(duì)比了5種破壁方法在破碎細(xì)胞及相應(yīng)RNA提取上的效果,添加珠打破壁步驟破碎細(xì)胞效果最好,顯示對(duì)16 h細(xì)胞RNA提取效果沒(méi)有明顯變化,但36 h和60 h細(xì)胞的RNA得率分別提高至979.6和785.6 ng/A600,...

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圖3不同時(shí)間CP值

圖2RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳圖4qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況

圖1酵母菌株G2在YPD中的生長(zhǎng)和糖耗曲線

菌株G2在20g/L葡萄糖培養(yǎng)基YPD中的生長(zhǎng)和糖耗曲線如圖1所示。葡萄糖在20h左右耗盡;綜合糖耗和生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)3階段對(duì)應(yīng)時(shí)段分別為:對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(EP)9～20h，二次生長(zhǎng)期(DP)20～48h,48～60h間進(jìn)入穩(wěn)定期(SP)。2.2三階段菌液試劑盒方法提取總....

圖2RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳

RNA提取物里的DNA污染情況是判斷RNA提取物質(zhì)量和確定其能否被正式使用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。簡(jiǎn)單的檢測(cè)方式是以RNA提取物為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳觀測(cè)不到目的條帶時(shí)，視為RNA提取物里的DNA污染可以忽略。本實(shí)驗(yàn)為了便于量化比較不同階段RNA提取物的DNA污染程度，同時(shí)....

圖4qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況

圖3不同時(shí)間CP值由圖3和圖4可知，ACT1基因和CYR1基因的表達(dá)中，以RNA提取物為模板的CP值一般認(rèn)為≈35或≥35，說(shuō)明RNA提取物中無(wú)DNA污染或其中DNA污染可以忽略;圖3顯示16h樣品DNA污染可以忽略，而36h和60h樣品則存在一定程度的DNA污染;如圖4....

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