目的:設(shè)計(jì)以P_GAP為啟動(dòng)子的組成型質(zhì)粒,構(gòu)建高效表達(dá)重組豬胰蛋白酶原的畢赤酵母X33菌株,獲得重組豬胰蛋白酶。方法:首先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33,表達(dá)重組豬胰蛋白酶原,經(jīng)腸激酶激活,純化提取得到重組豬胰蛋白酶。結(jié)果:篩選到高效表達(dá)重組豬胰蛋白酶原的畢赤酵母X33菌株,獲得了重組豬胰蛋白酶。結(jié)論:以P_GAP為啟動(dòng)子的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33后表達(dá)的重組豬胰蛋白酶原避免了補(bǔ)加甲醇帶來(lái)的危害,且操作方便,大大縮短了周期,提高了生產(chǎn)效率,避免了動(dòng)物源性污染。

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

圖1X33/pGAP-PT表達(dá)上清的SDS-PAGE

突變體在胰島素原酶切實(shí)驗(yàn)中胰島素得率較高，因此，我們研究了使用PGAP、PGAP1、PGAP2、PGAP3和PGAP4啟動(dòng)子的突變體的胰蛋白酶原表達(dá)情況。不同啟動(dòng)子突變體的表達(dá)上清SDS-PAGE顯示有目的蛋白表達(dá)，且X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP4-PT1表達(dá)....

圖3X33/pGAP-PT與X33/pGAP-PT1上清SDS-PAGE對(duì)比M：蛋白marker;1:X33/pGAP-PT;2:X33/pGAP-PT1

將X33/pGAP1-PT1進(jìn)行5L發(fā)酵，離心取上清，對(duì)表達(dá)上清的胰蛋白酶原進(jìn)行捕獲、激活和純化，從色譜圖（圖6）可以看到，通過(guò)苯甲醚親和層析得到了純度較高的胰蛋白酶，測(cè)得濃度為0.94mg/mL，比活6365U/mg，活性5983U/mL。圖4X33不同啟動(dòng)子表....

圖2X33/pGAP-PT1表達(dá)上清的SDS-PAGE

圖1X33/pGAP-PT表達(dá)上清的SDS-PAGE2.3活性測(cè)定

圖8X33/pGAP1-PT1的LC-MS圖

圖7胰蛋白酶的HPLC圖3討論

本文編號(hào)：3915885