DEPTOR(DEP-domain containg mTOR-interacting protein)作為mTOR(mammalian target of rapamycin)的結(jié)合蛋白,通過與mTOR直接結(jié)合并抑制mTORC1和mTORC2的活性,在細(xì)胞生長、代謝、凋亡和免疫等多種生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。鑒于DEPTOR對mTOR信號通路重要的調(diào)節(jié)作用,DEPTOR自身的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜,越來越多的研究顯示,DEPRTOR的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控高度依賴于特定的細(xì)胞類型與內(nèi)外環(huán)境。然而,目前并不清楚DEPTOR在轉(zhuǎn)錄水平上是否存在普遍的調(diào)控機(jī)制。如果能夠找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以在普遍情況下靶向調(diào)控DEPTOR表達(dá),或許可以為DEPTOR相關(guān)的信號通路及疾病的研究提供新思路。在本研究中,我們運(yùn)用免疫印跡、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、基因沉默/敲除等生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53靶向調(diào)控DEPTOR表達(dá),抑制細(xì)胞生長并減弱化療敏感性。得出這一結(jié)論的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)依據(jù)為:(1)在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和小鼠體內(nèi)器官中,DEPTOR的表達(dá)水平與p53的...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
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英文摘要
縮略詞表
1 引言
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞系與菌株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 抗體
        2.1.4 質(zhì)粒、siRNA和 sgRNA
        2.1.5 主要試劑耗材
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
        2.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.4 細(xì)胞感染
        2.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建與提取
        2.2.7 細(xì)胞系的構(gòu)建
        2.2.8 qRT-PCR
        2.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測
        2.2.10 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)
        2.2.11 細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)
        2.2.12 克隆形成實(shí)驗(yàn)
        2.2.13 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)
        2.2.14 蛋白免疫印跡
        2.2.15 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果
    3.1 DEPTOR的表達(dá)受p53 調(diào)控
        3.1.1 p53 活性與DEPTOR的蛋白水平成正相關(guān)
        3.1.2 p53 活性與DEPTOR的 m RNA水平成正相關(guān)
        3.1.3 缺失p53 下調(diào)DEPTOR表達(dá)
        3.1.4 小鼠體內(nèi)器官中,Deptor的表達(dá)受到p53 調(diào)控
    3.2 p53 直接結(jié)合并激活DEPTOR轉(zhuǎn)錄
        3.2.1 p53 可以激活DEPTOR的啟動子
        3.2.2 p53與DEPTOR啟動子上C序列靶向結(jié)合并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄
    3.3 p53 通過誘導(dǎo)DEPTOR的表達(dá)抑制細(xì)胞生長和存活并減慢細(xì)胞周期進(jìn)程
        3.3.1 p53 以密度依賴的方式調(diào)控DEPTOR的表達(dá)
        3.3.2 p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)抑制細(xì)胞生長和存活
        3.3.3 p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)減慢細(xì)胞周期進(jìn)程
    3.4 p53 介導(dǎo)的DEPTOR表達(dá)通過抑制AKT活性來阻礙細(xì)胞的生長和存活
        3.4.1 p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)抑制AKT的活性
        3.4.2 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR細(xì)胞的生長優(yōu)勢
        3.4.3 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR細(xì)胞的存活優(yōu)勢
    3.5 DOX處理下,p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生耐藥性
        3.5.1 DOX處理能夠促進(jìn)DEPTOR的表達(dá)
        3.5.2 DOX以 p53 依賴的方式增加DEPTOR的表達(dá)
        3.5.3 p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)減弱腫瘤細(xì)胞對DOX的化療敏感性
        3.5.4 DOX處理下p53 介導(dǎo)的DEPTOR的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡
4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方
綜述 DEPTOR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
作者簡介及在讀期間所取得研究成果



本文編號：3880597