DEPTOR(DEP-domain containg mTOR-interacting protein)作為mTOR(mammalian target of rapamycin)的結(jié)合蛋白,通過與mTOR直接結(jié)合并抑制mTORC1和mTORC2的活性,在細胞生長、代謝、凋亡和免疫等多種生物學進程中發(fā)揮著關鍵的調(diào)控作用。鑒于DEPTOR對mTOR信號通路重要的調(diào)節(jié)作用,DEPTOR自身的調(diào)控機制十分復雜,越來越多的研究顯示,DEPRTOR的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控高度依賴于特定的細胞類型與內(nèi)外環(huán)境。然而,目前并不清楚DEPTOR在轉(zhuǎn)錄水平上是否存在普遍的調(diào)控機制。如果能夠找到一個轉(zhuǎn)錄因子可以在普遍情況下靶向調(diào)控DEPTOR表達,或許可以為DEPTOR相關的信號通路及疾病的研究提供新思路。在本研究中,我們運用免疫印跡、染色質(zhì)免疫沉淀技術、實時熒光定量PCR、雙熒光素酶報告基因技術、基因沉默/敲除等生物化學與分子生物學相關技術發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53靶向調(diào)控DEPTOR表達,抑制細胞生長并減弱化療敏感性。得出這一結(jié)論的關鍵實驗依據(jù)為:(1)在體外培養(yǎng)的腫瘤細胞和小鼠體內(nèi)器官中,DEPTOR的表達水平與p53的...

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【學位級別】：碩士

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縮略詞表
1 引言
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞系與菌株
        2.1.2 化合物
        2.1.3 抗體
        2.1.4 質(zhì)粒、siRNA和 sgRNA
        2.1.5 主要試劑耗材
        2.1.6 實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2.2 細胞凍存與復蘇
        2.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.4 細胞感染
        2.2.5 細胞計數(shù)
        2.2.6 質(zhì)粒構(gòu)建與提取
        2.2.7 細胞系的構(gòu)建
        2.2.8 qRT-PCR
        2.2.9 雙熒光素酶報告基因檢測
        2.2.10 染色質(zhì)免疫沉淀技術
        2.2.11 細胞生長實驗
        2.2.12 克隆形成實驗
        2.2.13 流式細胞儀檢測細胞周期實驗
        2.2.14 蛋白免疫印跡
        2.2.15 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果
    3.1 DEPTOR的表達受p53 調(diào)控
        3.1.1 p53 活性與DEPTOR的蛋白水平成正相關
        3.1.2 p53 活性與DEPTOR的 m RNA水平成正相關
        3.1.3 缺失p53 下調(diào)DEPTOR表達
        3.1.4 小鼠體內(nèi)器官中,Deptor的表達受到p53 調(diào)控
    3.2 p53 直接結(jié)合并激活DEPTOR轉(zhuǎn)錄
        3.2.1 p53 可以激活DEPTOR的啟動子
        3.2.2 p53與DEPTOR啟動子上C序列靶向結(jié)合并誘導其轉(zhuǎn)錄
    3.3 p53 通過誘導DEPTOR的表達抑制細胞生長和存活并減慢細胞周期進程
        3.3.1 p53 以密度依賴的方式調(diào)控DEPTOR的表達
        3.3.2 p53 介導的DEPTOR的表達抑制細胞生長和存活
        3.3.3 p53 介導的DEPTOR的表達減慢細胞周期進程
    3.4 p53 介導的DEPTOR表達通過抑制AKT活性來阻礙細胞的生長和存活
        3.4.1 p53 介導的DEPTOR的表達抑制AKT的活性
        3.4.2 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR細胞的生長優(yōu)勢
        3.4.3 抑制AKT活性可以抑制?C-DEPTOR細胞的存活優(yōu)勢
    3.5 DOX處理下,p53 介導的DEPTOR的表達抑制細胞凋亡并產(chǎn)生耐藥性
        3.5.1 DOX處理能夠促進DEPTOR的表達
        3.5.2 DOX以 p53 依賴的方式增加DEPTOR的表達
        3.5.3 p53 介導的DEPTOR的表達減弱腫瘤細胞對DOX的化療敏感性
        3.5.4 DOX處理下p53 介導的DEPTOR的表達促進細胞凋亡
4 討論
參考文獻
附錄 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方
綜述 DEPTOR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究進展
    參考文獻
作者簡介及在讀期間所取得研究成果



本文編號：3880597