滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)是一種基于病毒DNA復(fù)制而發(fā)明的新技術(shù)。近些年,RCA技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)的檢測(cè)。在miRNA檢測(cè)研究領(lǐng)域中,鑒別高度同源的家族miRNAs成為該研究領(lǐng)域的瓶頸。本研究引入新型的RCA技術(shù)來增加鑒別的靈敏度和特異性,進(jìn)一步提高家族miRNA鑒別的靈敏度,滾環(huán)擴(kuò)增的程度用相對(duì)熒光強(qiáng)度來表示。研究結(jié)果顯示,T4 RNA連接酶2可在RCA的環(huán)化過程中實(shí)現(xiàn)最大的環(huán)化效率,從而提高RCA的檢測(cè)特異性。本文利用優(yōu)化的RCA技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)let 7高度同源的家族miRNAs高靈敏度的鑒別,靈敏度可達(dá)5 fmol。let 7a的滾環(huán)探針對(duì)Let 7a這一miRNA擴(kuò)增后的相對(duì)熒光強(qiáng)度為1 550,而對(duì)其他的家族miRNA相對(duì)熒光強(qiáng)度僅為260。其他的家族miRNA探針在鑒別時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度也顯示了較大的差異。而依靠傳統(tǒng)的RT-qPCR方法的鑒別靈敏度是4 pmol,與本研究相比,靈敏度低了近1 000倍。本研究的結(jié)果表明,利用RCA技術(shù)鑒別高度同源性miRNA...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 寡核酸序列
        1.1.2 試劑
        1.1.3 主要儀器
    1.2 滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)
    1.3 環(huán)化
    1.4 滾環(huán)擴(kuò)增
    1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNAs
    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 RCA方法實(shí)現(xiàn)鑒別家族miRNA
        2.1.1 Let 7a的鑒別
        2.1.2 let 7b、let 7c、let 7 d、let 7e的鑒別
    2.2 RCA鑒別let 7a的高靈敏度
3 討論
    3.1 RCA技術(shù)的檢測(cè)應(yīng)用
    3.2 利用RCA方法鑒別let 7家族miRNAs
    3.3 重要研究結(jié)果
        3.3.1 SYBR GreenⅡ熒光檢測(cè)
        3.3.2 應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)微小RNA(miRNA)
        3.3.3 利用滾環(huán)擴(kuò)增方法鑒別高度同源的miRNAs



本文編號(hào)：3873343