胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶,可特異切割精氨酸及賴氨酸C端肽鍵。重組人源陽(yáng)離子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的穩(wěn)定性明顯高于重組人源陰離子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比較ht1和ht2的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu),二者的氨基酸序列同源性為95%,rht1比rht2多1對(duì)二硫鍵Cys139-Cys206。為解釋該二硫鍵對(duì)其穩(wěn)定性的作用,構(gòu)建rht1的Cys139-Cys206二硫鍵缺失突變體rht1-dC139S-C206S和rht2的增加該對(duì)二硫鍵的突變體rht2-S139C-S206C。進(jìn)行了重組表達(dá)和純化,并測(cè)定rht1、rht2及兩個(gè)突變體的酶學(xué)性質(zhì),對(duì)比其穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型rht1、rht2相比,突變體的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)km和kcat值與最適pH均未有較大差異。但在pH3～12條件下的穩(wěn)定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。對(duì)比其熱穩(wěn)定性,40℃保溫4 h,rht1殘余活性為92...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶的重組表達(dá)和純化
    1.3 活性測(cè)定
    1.4 純度測(cè)定
    1.5 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定
        1.5.1 最適pH和最適溫度的測(cè)定
            1.5.1.1最適pH的測(cè)定:
            1.5.1.2最適溫度的測(cè)定:
    1.6 對(duì)酶穩(wěn)定性影響
        1.6.1 二硫鍵突變對(duì)酶pH穩(wěn)定性影響
        1.6.2 二硫鍵突變對(duì)酶熱穩(wěn)定性影響
    1.7 結(jié)構(gòu)分析
2 結(jié)果
    2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及酶的重組表達(dá)和純化
    2.2 rht1二硫鍵缺失和rht2二硫鍵增加未改變催化效率
    2.3 rht1二硫鍵缺失和rht2二硫鍵增加對(duì)最適pH無(wú)影響
    2.4 二硫鍵增加升高rht2最適溫度
    2.5 二硫鍵缺失降低ht1的pH穩(wěn)定性, 二硫鍵增加提高h(yuǎn)t2的pH穩(wěn)定性
    2.6 二硫鍵缺失降低rht1的熱穩(wěn)定性,二硫鍵增加提高rht2的熱穩(wěn)定性
    2.7 高級(jí)結(jié)構(gòu)模擬分析C139-C296二硫鍵對(duì)結(jié)構(gòu)的作用
    2.8 二硫鍵缺失使rht1-dC139S-C206S降解增加,二硫鍵增加使rht2-S139C-S206C降解減少
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