寡孢節(jié)叢孢(Arthrobobrys oligospora)是一種典型的捕食線蟲(chóng)真菌,通過(guò)產(chǎn)生特殊的捕食器官-三維菌網(wǎng)(three-dimensional networks)來(lái)捕捉和侵染線蟲(chóng),寡孢節(jié)叢孢是研究真菌與線蟲(chóng)相互作用的代表性菌株。鈣離子/鈣調(diào)素依賴(lài)的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent kinases,CaMKs)是一類(lèi)重要的多功能信號(hào)蛋白,位于G蛋白信號(hào)的下游,在激素或次級(jí)信使的調(diào)控下,參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),調(diào)節(jié)多種不同的生物學(xué)過(guò)程。本論文選取寡孢節(jié)叢孢為試驗(yàn)菌株,以5種CaMKs(CaMK A,AOL s00078g95;CaMK B,AOL s00083g485;CaMKK Cl,AOL_s00215g625;CaMKKC2,AOL_s00110g86;CaMKD,AOL_s00080g218)為研究對(duì)象,通過(guò)基因敲除、表型特征比較、環(huán)境脅迫耐受試驗(yàn)和熒光定量PCR等技術(shù),初步探究了 5種CaMKs在寡孢節(jié)叢孢生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫耐受、產(chǎn)抱和致病過(guò)程中的功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.CaMKs的功能...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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摘要
Abstract
第一章 食線蟲(chóng)真菌及CaMK蛋白研究進(jìn)展
    1 植物病原線蟲(chóng)的危害及生防因子的研究概況
    2 食線蟲(chóng)真菌的研究概況
    3 CaMK蛋白的功能研究進(jìn)展
    4 本論文的選題依據(jù)及研究意義
第二章 CaMKs蛋白的序列特征和聚類(lèi)分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 CaMK蛋白序列來(lái)源
        2.2 CaMK蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析
        2.3 CaMK蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析及其命名
    3 結(jié)果
        3.1 CaMK蛋白的部分理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)域分析
        3.2 CaMK蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析
    4 討論
第三章 CaMK蛋白編碼基因的敲除和轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證
    1. 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        2.1 試驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        2.2 主要溶液及培養(yǎng)基
        2.3 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑盒
        2.4 主要儀器及設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 敲除載體構(gòu)建方法
        3.2 敲除引物設(shè)計(jì)
            3.2.1 29 bp同源臂序列及擴(kuò)增潮霉素抗性基因的引物
            3.2.2 擴(kuò)增5個(gè)CaMK基因的引物
        3.3 寡孢節(jié)叢孢基因組提取
        3.4 質(zhì)粒pSCN44和pRS426的提取
        3.5 pRS426質(zhì)粒雙酶切及片段純化回收
        3.6 目的片段的擴(kuò)增和純化回收
        3.7 FY834菌株感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
        3.8 酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取
        3.9 酵母轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證
        3.10 敲除載體全長(zhǎng)片段擴(kuò)增及純化回收
        3.11 寡孢節(jié)叢孢原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
        3.12 轉(zhuǎn)化子基因組提取
        3.13 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
        3.14 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的Southern blot驗(yàn)證
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 寡孢節(jié)叢孢5個(gè)CaMK蛋白編碼基因上下游同源片段及hph基因片段擴(kuò)增
        4.2 pRS426質(zhì)粒雙酶切
        4.3 酵母轉(zhuǎn)化子
        4.4 酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒PCR驗(yàn)證
        4.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
        4.6 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Southern blot驗(yàn)證
    5 討論
        5.1 敲除載體的構(gòu)建
        5.2 原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化
        5.3 敲除轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
        5.4 敲除轉(zhuǎn)化子Southern blot驗(yàn)證
    6 小結(jié)
第四章 寡孢節(jié)叢孢野生株與△CaMKs突變株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢分析
    1 前言
    2. 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2 主要培養(yǎng)基
        2.3 主要藥品
        2.4 主要儀器及設(shè)備
    3. 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 生長(zhǎng)速率比較
        3.2 產(chǎn)孢的比較
        3.3 野生型菌株和突變菌株樣品總RNA的提取
        3.4 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
        3.5 相關(guān)基因的選取及引物設(shè)計(jì)
        3.6 Real-Time PCR
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 CaMK蛋白在寡孢節(jié)叢孢中表達(dá)量分析
        4.2 CaMK基因突變菌株生長(zhǎng)速率及菌落形態(tài)比較
        4.3 CaMK蛋白突變菌株的產(chǎn)孢能力比較
        4.4 產(chǎn)孢相關(guān)基因定量結(jié)果
    5 討論
        5.1 生長(zhǎng)速率和菌落形態(tài)比較
        5.2 CaMK蛋白在菌絲生長(zhǎng)不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平比較
        5.3 產(chǎn)孢比較
        5.4 產(chǎn)孢相關(guān)基因定量結(jié)果
    6 小結(jié)
第五章 寡孢節(jié)叢孢野生株與△CaMKs突變株的環(huán)境脅迫耐受性分析
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2 主要培養(yǎng)基
        2.3 主要藥品
        2.4 主要儀器及設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 抗高滲比較
        3.2 抗氧化比較
        3.3 抗細(xì)胞壁合成比較
        3.4 熱應(yīng)激比較
        3.5 抗紫外輻射比較
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 CaMK蛋白突變菌株的抗高滲比較
        4.2 CaMK蛋白突變菌株的抗氧化比較
        4.3 CaMK蛋白突變菌株的抗細(xì)胞壁合成干擾劑的能力比較
        4.4 CaMK蛋白突變菌株的熱應(yīng)激敏感性比較
        4.5 CaMK蛋白突變菌株高溫脅迫下孢子萌發(fā)率比較
        4.6 CaMK蛋白突變菌株高溫脅迫恢復(fù)能力比較
        4.7 CaMK蛋白敲除突變菌株高溫脅迫下產(chǎn)孢量比較
        4.8 CaMK蛋白突變菌株抗紫外輻射比較
    5 討論
        5.1 抗逆性比較
        5.2 抗氧化比較
        5.3 抗細(xì)胞壁合成比較
        5.4 熱應(yīng)激比較
        5.5 抗紫外輻射比較
    6 小結(jié)
第六章 寡孢節(jié)叢孢野生型菌株與△CaMKs突變菌株的捕器形成和致病性分析
    1 前言
    2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.2 主要培養(yǎng)基
        2.3 主要藥品
        2.4 主要儀器及設(shè)備
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 捕器數(shù)量及形態(tài)比較
        3.2 殺線蟲(chóng)率比較
    4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 CaMK蛋白突變菌株的捕器形態(tài)比較
        4.2 CaMK蛋白突變菌株的捕器數(shù)量比較
        4.3 CaMK蛋白突變菌株的殺線蟲(chóng)率比較
    5 討論
    6 小結(jié)
全文小結(jié)及存在的問(wèn)題
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄Ⅰ 論文中使用的縮寫(xiě)及中英文對(duì)照
    附錄Ⅱ 論文中使用的質(zhì)粒圖譜
    附錄Ⅲ 論文RT-PCR序列
    附錄Ⅳ 碩士階段發(fā)表的文章
    附錄Ⅴ 碩士階段獲得的獎(jiǎng)勵(lì)和榮譽(yù)
致謝



本文編號(hào)：3827541