惡臭假單胞菌KT2440是一種具有代謝多樣性且可適應不同環(huán)境的非致病的模式菌株。除用于研究基礎代謝以外,惡臭假單胞菌KT2440還被廣泛應用于生產(chǎn)實踐。因此,研究該菌株的生存模式以及基礎代謝途徑對實際生產(chǎn)應用意義重大。FinR是假單胞菌中LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,負責在氧化脅迫條件下誘導鐵氧還蛋白-NADP(+)還原酶Fpr-1的表達,增強菌株抵抗氧化脅迫的能力。除此信息外目前我們對FinR功能了解甚少。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序和qRT-PCR技術(shù)在惡臭假單胞菌KT2440中篩選出11個受finR調(diào)控的新靶基因,并進一步深入探究了FinR調(diào)控nicC和nicX操縱子的生理功能和機理。具體結(jié)果概括如下:1.轉(zhuǎn)錄組測序和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)FinR顯著調(diào)控nicC和nicX操縱子的表達前人研究發(fā)現(xiàn)FinR負責在氧化脅迫條件下誘導鐵氧還蛋白-NADP(+)還原酶Fpr-1的表達,但其他功能知之甚少。為探究FinR的其他功能,本文首先通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ふ蚁啾纫吧驮趂inR突變體中表達有顯著變化的基因,然后利用qRT-PCR實驗驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,發(fā)現(xiàn)可能受FinR調(diào)控的11個操縱子。其中,相比野生型...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 惡臭假單胞菌KT2440
        1.1.1 惡臭假單胞菌KT2440簡介
        1.1.2 惡臭假單胞菌KT2440的應用
    1.2 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-FinR
        1.2.1 LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子
        1.2.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FinR的功能
    1.3 煙酸
        1.3.1 煙酸及其應用
        1.3.2 不同菌株中煙酸代謝通路
        1.3.3 假單胞菌中的煙酸代謝調(diào)控
    1.4 本文的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與儀器
            2.1.2.1 常用試劑
            2.1.2.2 主要儀器
            2.1.2.3 主要培養(yǎng)基及溶液配制
    2.2 方法
        2.2.1 菌株培養(yǎng)
        2.2.2 常見分子生物學基本操作
            2.2.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離(堿變性法)
            2.2.2.2 PCR純化
            2.2.2.3 DNA酶切
            2.2.2.4 DNA凝膠回收
            2.2.2.5 DNA酶連
            2.2.2.6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細胞的制備
        2.2.3 工具載體的構(gòu)建
        2.2.4 通過兩親本接合方法將質(zhì)粒導入KT2440中
        2.2.5 惡臭假單胞菌KT2440感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化
        2.2.6 惡臭假單胞菌KT2440基因缺失突變體的構(gòu)建
        2.2.7 β-半乳糖苷酶活性的測定
        2.2.8 表型實驗菌落觀察
        2.2.9 惡臭假單胞菌KT2440總RNA的抽提
        2.2.10 總RNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.11 qRT-PCR比較基因表達變化
        2.2.12 轉(zhuǎn)錄組測序
        2.2.13 BCA法檢測蛋白濃度
        2.2.14 EMSA實驗
        2.2.15 DNase I足跡測定實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 轉(zhuǎn)錄組學分析揭示了受FinR影響的基因
        3.1.1 轉(zhuǎn)錄組測序
        3.1.2 惡臭假單胞菌KT2440中受FinR影響的基因
    3.2 FinR正調(diào)控nicC和nicX操縱子
        3.2.1 qRT-PCR和nic啟動子-lacZ融合表達檢測FinR對nic簇基因表達的作用
    3.3 FinR缺失削弱了菌株對煙酸的利用率
        3.3.1 液體培養(yǎng)基中菌株生長曲線測定
        3.3.2 固體培養(yǎng)基中的菌株煙酸利用實驗
    3.4 FinR與NicR協(xié)同調(diào)控nicC和nicX操縱子
    3.5 FinR和NicR可在體外結(jié)合nicC和nicX啟動子
        3.5.1 EMSA實驗確定FinR/NicR是否結(jié)合nicC/nicX啟動子
        3.5.2 DNase I足跡測定實驗確定FinR/NicR與 nicC/nicX啟動子結(jié)合位點
4 討論與展望
    4.1 討論
        4.1.1 FinR影響菌株煙酸代謝
        4.1.2 FinR調(diào)控組氨酸利用相關(guān)基因的表達
        4.1.3 氧化應激對nicC和nicX操縱子的表達沒有明顯影響
        4.1.4 FinR與nicC和nicX啟動子的精確結(jié)合序列
    4.2 展望
參考文獻
附錄A 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果
附錄B 本文所用引物
附錄C 論文發(fā)表和待發(fā)表情況
致謝



本文編號：3816886