近幾十年來,通過結(jié)構(gòu)、細胞和遺傳學(xué)的研究表明,細胞和細胞外基質(zhì)通過細胞黏著斑(Focal adhesion,FA)進行“由內(nèi)到外”和“由外到內(nèi)”的雙向信號傳導(dǎo),從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達和細胞骨架動態(tài)變化,來調(diào)控細胞的伸展、遷移、增殖和凋亡等過程。黏著斑是由跨膜受體整合素(Integrin)介導(dǎo)的,多種蛋白質(zhì)組裝而成的一種特殊結(jié)構(gòu)(包括整聯(lián)蛋白)。許多研究表明,ILK蛋白(Integrin-linked kinase)在細胞中廣泛表達,是黏著斑的重要蛋白質(zhì)組成之一,參與調(diào)控細胞骨架,以及通過和各種信號分子相互作用從而在許多信號通路中發(fā)揮功能。ILK與PINCH蛋白和Parvin蛋白形成三元復(fù)合物(IPP復(fù)合物),其中,ILK通過N-端ANK(ankyrin repeat)結(jié)構(gòu)域與PINCH中的LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合,通過C-端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain)與Parvin中的CH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在各種動物模型生物中的功能研究表明,ILK,PINCH和Parvin在胚胎發(fā)育中必不可少,在器官的發(fā)育過程中具有重要作用。IPP復(fù)合物在與細胞骨架動態(tài)調(diào)控密切相關(guān)的細胞運動過程中行使著重要作...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 課題背景
        1.1.1 黏著斑結(jié)構(gòu)和整合素蛋白
        1.1.2 IPP蛋白質(zhì)復(fù)合物及其功能
    1.2 冷凍電子顯微鏡學(xué)
    1.3 課題研究目的及意義
    1.4 研究內(nèi)容及技術(shù)路線
        1.4.1 研究內(nèi)容
        1.4.2 技術(shù)路線
第2章 實驗材料與方法
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 實驗儀器
        2.1.2 實驗材料
        2.1.3 實驗試劑的配制
        2.1.4 引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 分子克隆
            2.2.1.1 質(zhì)粒提取
            2.2.1.2 基因片段PCR擴增
            2.2.1.3 瓊脂糖凝膠電泳
            2.2.1.4 膠回收
            2.2.1.5 酶切連接
            2.2.1.6 感受態(tài)轉(zhuǎn)化
            2.2.1.7 陽性菌落篩選
            2.2.1.8 測序結(jié)果比對
        2.2.2 蛋白質(zhì)表達純化
            2.2.2.1 大腸桿菌擴增及誘導(dǎo)表達
            2.2.2.2 昆蟲細胞表達
            2.2.2.3 293E哺乳細胞表達
            2.2.2.4 細胞破碎
            2.2.2.5 鎳柱親和層析純化
            2.2.2.6 分子篩層析純化
            2.2.2.7 快速蛋白液相色譜
        2.2.3 SDS-PAGE
        2.2.4 免疫印跡鑒定
        2.2.5 感受態(tài)細胞制備
            2.2.5.1 DH5α細胞
            2.2.5.2 BL21和Rosetta感受態(tài)細胞制備
        2.2.6 蛋白濃縮
        2.2.7 負染制樣及拍攝
            2.2.7.1 制樣
            2.2.7.2 電鏡拍攝
        2.2.8 冷凍電鏡制樣及數(shù)據(jù)收集
            2.2.8.1 冷凍制樣
            2.2.8.2 圖像采集
            2.2.8.3 圖像加工處理
            2.2.8.4 顆粒挑選
            2.2.8.5 2D結(jié)構(gòu)的信息和分類
            2.2.8.6 初始結(jié)構(gòu)的計算
            2.2.8.7 結(jié)構(gòu)的細化
            2.2.8.8 3D結(jié)構(gòu)的分析
    2.3 本章小結(jié)
第3章 IPP復(fù)合物的表達及純化
    3.1 實驗內(nèi)容
        3.1.1 表達載體設(shè)計
        3.1.2 原核表達系統(tǒng)
            3.1.2.1 IPP運用不同載體共表達
            3.1.2.2 IPP運用共表達載體進行共表達
            3.1.2.3 ILK的突變C346S,C422S
        3.1.3 昆蟲表達系統(tǒng)
        3.1.4 293E細胞表達系統(tǒng)
        3.1.5 純化條件的篩選
    3.2 結(jié)果與分析
    3.3 本章小結(jié)
第4章 IPPCH2復(fù)合物
    4.1 IPPCH2功能驗證
    4.2 IPPCH2復(fù)合物的初步電鏡結(jié)果
    4.3 本章小結(jié)
第5章 IPP復(fù)合物的初步結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究
    5.1 IPP驗證
    5.2 IPP與 PXN蛋白復(fù)合物的純化
    5.3 IPP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的初步研究
    5.4 本章小結(jié)
第6章 總結(jié)與展望
參考文獻
致謝



本文編號：3807604