普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)是一類催化支鏈淀粉、普魯蘭多糖及相關(guān)聚合物的a-1,6糖苷鍵水解的淀粉脫支酶。由于普魯蘭酶水解支鏈淀粉分支點的特性,在糖化過程中添加普魯蘭酶,將減少所需的糖化酶用量以及糖化反應(yīng)時間,從而顯著提高淀粉生物質(zhì)的水解效率。因此,普魯蘭酶在食品、制藥、能源和高聚物材料等領(lǐng)域有重要的商業(yè)價值。而且,作為研究糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的工具,普魯蘭酶也受到了極大的關(guān)注。然而,多數(shù)普魯蘭酶的催化效率和穩(wěn)定性較低,因此面臨著生產(chǎn)成本提高,無法大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的問題。長野芽孢桿菌(Bacillus naganoensis)來源的普魯蘭酶具有耐酸耐熱的酶學(xué)特性,在pH 4.5,60°C條件下酶活水平最高。本論文基于序列結(jié)構(gòu)信息對B.naganoensis普魯蘭酶進行蛋白質(zhì)工程改造。通過截斷氨基酸序列的無序區(qū)域、進化偶聯(lián)位點飽和突變、三密碼子飽和突變等策略,提高了B.naganoensis普魯蘭酶的酶活、比活、催化效率以及應(yīng)用效果。此外,分別通過在酶分子N-末端融合帶負電的多肽和過量表達羧肽酶的方式提高了其在E.coli中的胞外分泌效率。主要研究結(jié)果如下:(1)基于B.nagano...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞注釋表
第一章 緒論
    1.1 普魯蘭酶
        1.1.1 普魯蘭酶的分類
        1.1.2 普魯蘭酶的相關(guān)應(yīng)用
    1.2 普魯蘭酶的酶學(xué)特性
    1.3 普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與催化機制
    1.4 普魯蘭酶分子改造的研究進展
    1.5 酶分子改造策略
        1.5.1 蛋白質(zhì)工程
        1.5.2 定向進化
        1.5.3 理性設(shè)計
        1.5.4 半理性設(shè)計
    1.6 普魯蘭酶的異源表達
    1.7 本研究的目的和意義
    1.8 主要研究內(nèi)容
第二章 基于序列無序性截短改造普魯蘭酶
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 試劑和儀器
        2.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        2.2.4 基因工程操作
        2.2.5 重組質(zhì)粒提取及測序
        2.2.6 重組菌的搖瓶發(fā)酵
        2.2.7 重組蛋白的純化
        2.2.8 普魯蘭酶活力測定及SDS-PAGE
        2.2.9 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析
        2.2.10 重組蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 普魯蘭酶氨基酸序列的無序性分析
        2.3.2 截短突變體的構(gòu)建與重組表達
        2.3.3 截短突變體的動力學(xué)參數(shù)測定
        2.3.4 截短突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析
        2.3.5 重組蛋白的圓二色(Circular dichroism,CD)分析
        2.3.6 重組蛋白結(jié)構(gòu)模擬及比對分析
    2.4 小結(jié)
第三章 基于進化偶聯(lián)飽和突變策略的普魯蘭酶全序列分析
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株與質(zhì)粒
        3.2.2 試劑和儀器
        3.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        3.2.4 基因工程操作
        3.2.5 自誘導(dǎo)紅色普魯蘭平板可視化篩選單克隆
        3.2.6 重組菌的搖瓶發(fā)酵
        3.2.7 重組蛋白的純化
        3.2.8 普魯蘭酶活力測定及SDS-PAGE
        3.2.9 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析
        3.2.10 普魯蘭酶3D結(jié)構(gòu)模擬
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 普魯蘭酶氨基酸序列的進化偶聯(lián)分析
        3.3.2 ECs的選擇與突變文庫的構(gòu)建
        3.3.3 突變文庫的篩選
        3.3.4 ECSM雙位點突變體的酶活及動力學(xué)參數(shù)測定
        3.3.5 ECSM雙位點突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析
        3.3.6 位點A232/I226 的距離分析
    3.4 小結(jié)
第四章 普魯蘭酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進化偶聯(lián)分析及改造
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 試劑和儀器
        4.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        4.2.4 基因工程操作
        4.2.5 自誘導(dǎo)紅色普魯蘭平板可視化篩選單克隆
        4.2.6 重組菌的搖瓶發(fā)酵
        4.2.7 重組蛋白的純化
        4.2.8 普魯蘭酶活力測定及SDS-PAGE
        4.2.9 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析
        4.2.10 預(yù)反應(yīng)態(tài)(pre-reaction state,PRS)分子動力學(xué)模擬
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進化偶聯(lián)分析
        4.3.2 ECs的選擇與突變文庫的構(gòu)建
        4.3.3 兩步法突變方法有效性驗證
        4.3.4 ECSM雙位點突變體的酶活及動力學(xué)參數(shù)測定
        4.3.5 ECSM雙位點突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析
        4.3.6 ECSM四位點突變體的構(gòu)建與表達
        4.3.7 ECSM四位點突變體的酶學(xué)性質(zhì)分析
        4.3.8 ECs保守性及距離分析
        4.3.9 PRS分子動力學(xué)模擬
    4.4 小結(jié)
第五章 普魯蘭酶催化口袋活性位點組合飽和突變
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株與質(zhì)粒
        5.2.2 試劑和儀器
        5.2.3 培養(yǎng)基及溶液
        5.2.4 基因工程操作
        5.2.5 自誘導(dǎo)紅色普魯蘭平板可視化篩選單克隆
        5.2.6 重組菌的搖瓶發(fā)酵
        5.2.7 重組蛋白的純化
        5.2.8 普魯蘭酶活力測定及SDS-PAGE
        5.2.9 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析
        5.2.10 重組蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 催化口袋改造位點的選擇
        5.3.2 TCSM突變文庫構(gòu)建及活性位點的識別
        5.3.3 位點D787和M621 突變文庫的構(gòu)建
        5.3.4 重組蛋白的比活力與動力學(xué)參數(shù)測定
        5.3.5 重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)分析
        5.3.6 重組蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬及分析
    5.4 小結(jié)
第六章 普魯蘭酶在E.coli中的分泌表達及突變體的應(yīng)用
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 菌株與質(zhì)粒
        6.2.2 試劑和儀器
        6.2.3 培養(yǎng)基與溶液
        6.2.4 基因工程操作
        6.2.5 重組菌的搖瓶發(fā)酵
        6.2.6 重組蛋白的純化
        6.2.7 普魯蘭酶活力測定及SDS-PAGE
        6.2.8 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析
        6.2.9 糖化反應(yīng)
        6.2.10 糖化產(chǎn)物HPLC分析
        6.2.11 DE值、DX值和IM值的測定
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 WT的 N-末端融合負電肽鏈對其在E.coli中胞外分泌的影響
        6.3.2 DN106的N-末端融合負電肽鏈對其在E.coli中胞外分泌的影響
        6.3.3 細胞壁通透性調(diào)控
        6.3.4 突變體的組合、表達及活性測定
        6.3.5 組合突變體在糖化反應(yīng)中的效果分析
    6.4 小結(jié)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
論文主要創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄 :表
附錄 :圖
附錄 :作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號：3781492