發(fā)布時間：2023-04-02 04:29

　　近年來,噬菌體裂解酶已廣泛用于生物控制中代替抗生素,并且它們在人類,動物和其他養(yǎng)殖動物的傳染病的預防和治療中起重要作用。裂解酶通常都在原核的大腸桿菌系統(tǒng)中表達,但存在產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、可溶性差以及細胞毒性高等缺點。因此,本研究旨在構建出高效安全的酵母表達系統(tǒng)以生產(chǎn)獲得廣譜嵌合裂解酶ClyV,為實現(xiàn)臨床應用進一步奠定基礎。本研究將擴增得到的ClyV基因,經(jīng)雙酶切后與酵母表達載體pPIC3.5k和pPIC9k相連接得到了pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV,采用電轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母中,并通過遺傳霉素抗性平板篩選得到了陽性酵母多拷貝菌株。利用甲醇對上述得到的畢赤酵母pPIC3.5k-ClyV和pPIC9k-ClyV工程菌進行誘導發(fā)酵,而后經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到了裂解酶ClyVp1和ClyVp2。同時對本實驗室保藏的大腸桿菌BL21/pET 28a-ClyV工程菌也進行原核胞內(nèi)誘導表達,并經(jīng)鎳柱親和層析純化得到了裂解酶ClyVe。ClyV裂解酶在大腸桿菌和畢赤酵母中均實現(xiàn)了正確表達,就ClyV的表達量和溶解度來看酵母系統(tǒng)相對更佳為了進一步比較畢赤酵母來源的ClyVp與大腸桿菌來源的...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號縮寫說明
1 緒論
    1.1 裂解酶的結構和溶菌機制
    1.2 噬菌體裂解酶的優(yōu)勢
        1.2.1 不產(chǎn)生細菌抗性
        1.2.2 特異性介于抗生素和噬菌體之間
        1.2.3 刺激產(chǎn)生的相關抗體不會削弱其殺菌作用
        1.2.4 作用高效迅速
        1.2.5 可與抗生素產(chǎn)生協(xié)同效應
    1.3 裂解酶改造
    1.4 嵌合裂解酶ClyV
    1.5 裂解酶異源表達系統(tǒng)
    1.6 酵母表達系統(tǒng)
        1.6.1 常見的幾個酵母表達系統(tǒng)
        1.6.2 設計最佳外源蛋白表達系統(tǒng)
        1.6.3 畢赤酵母的啟動元件
        1.6.4 畢赤酵母常見菌株類型
        1.6.5 畢赤酵母表達載體
        1.6.6 畢赤酵母的外源基因偏好
        1.6.7 畢赤酵母的翻譯和修飾
        1.6.8 畢赤酵母多拷貝
        1.6.9 畢赤酵母的發(fā)酵
    1.7 本研究立題依據(jù)
    1.8 本研究的目的意義
2 異源重組表達嵌合裂解酶及其相關酶學性質(zhì)的比較
    2.1 實驗材料與試劑
        2.1.1 菌株
        2.1.2 引物
        2.1.3 試劑和材料
        2.1.4 培養(yǎng)基的配制
        2.1.5 溶液的配制
        2.1.6 儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸表達系統(tǒng)克隆工程菌ClyV的表達和活化
        2.2.2 大腸桿菌工程菌的擴大培養(yǎng)
        2.2.3 大腸桿菌工程菌的誘導表達
        2.2.4 菌體收集與破碎
    2.3 酵母表達ClyV
        2.3.1 ClyV基因的提取
        2.3.2 pPIC3.5k-ClyV和 pPIC3.5k-ClyV表達載體的構建
        2.3.3 轉(zhuǎn)入酵母
        2.3.4 重組工程菌的篩選及驗證
        2.3.5 重組工程菌的異源表達
        2.3.6 胞外分泌和胞內(nèi)表達產(chǎn)物的收集和純化
        2.3.7 樣品預處理和蛋白純化
        2.3.8 SDS-PAGE電泳
        2.3.9 蛋白濃度測定
        2.3.10 去除內(nèi)毒素
        2.3.11 內(nèi)毒素檢測
    2.4 異源裂解酶的定性定量殺菌測試
    2.5 異源ClyV的特征比較
        2.5.1 異源ClyV的濃度依賴性
        2.5.2 溫度對異源ClyV的影響
        2.5.3 pH對異源ClyV活性的影響
        2.5.4 離子強度對ClyV活性的影響
        2.5.5 EDTA濃度對異源ClyV活性的影響
        2.5.6 酵母ClyV的殺菌譜
        2.5.7 異源ClyV的細胞毒性實驗
3 結果
    3.1 ClyV酵母表達載體的構建
    3.2 酵母重組工程菌多拷貝篩選
    3.3 異源ClyV表達純化
    3.4 異源ClyV的殺菌活性分析
    3.5 ClyV的酶活性質(zhì)分析
    3.6 ClyV的殺菌譜
    3.7 ClyV內(nèi)毒素含量及其細胞毒性
4 討論
5 全文總結
    5.1 本研究的主要結論
    5.2 本研究創(chuàng)新之處
    5.3 研究展望
致謝
參考文獻
攻讀學位期間研究成果



本文編號：3778536