近幾年報(bào)道的N6-甲基腺嘌呤(6mA)作為一種新的表觀遺傳標(biāo)記在各種真核生物調(diào)節(jié)生命進(jìn)程中起著非常重要得作用。然而,6mA影響DNA聚合酶催化DNA復(fù)制的分子機(jī)制仍然不清楚。因此本課題在分子水平上研究6mA對(duì)DNA復(fù)制的影響,我們使用Y家族人類DNA聚合酶eta作為模型并采用生物化學(xué)和生物物理的方法來研究人類DNA聚合酶eta跨過6mA進(jìn)行合成的分子機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn)DNA模板上的6mA及其中間代謝產(chǎn)物次黃嘌呤(I)都會(huì)抑制DNA聚合酶eta催化DNA的復(fù)制。DNA模板上的6mA會(huì)使dTTP摻入效率降低13倍,下一個(gè)堿基插入效率下降低8.5倍。DNA模板上的I對(duì)面則更優(yōu)先摻入dCTP。相比6mA:C錯(cuò)配,6mA:T錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致聚合酶eta失去優(yōu)先摻入能力,并且I:C配對(duì)比I:T配對(duì)更利于堿基摻入。dTTP和dCTP分別摻入模板上6mA與I對(duì)面都具有爆發(fā)相。然而,相比于DNA模板上A對(duì)面插入dTTP,模板上的6mA通過降低堿基的插入速率和增加解離常數(shù)使得dTTP和dCTP的插入效率分別降低了2.3倍和5.6倍。生物物理結(jié)合實(shí)驗(yàn)則表明相比未發(fā)生甲基化的A,DNA模板上的6mA和I都降低了二...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞
第一章 前言
    1.1 研究背景
        1.1.1 DNA聚合酶結(jié)構(gòu)、功能及其復(fù)制的分子機(jī)制
        1.1.2 DNA損傷及甲基化修飾
        1.1.3 人類DNA聚合酶eta結(jié)果與生物學(xué)功能分析
        1.1.4 DNA聚損傷與人類疾病
    1.2 研究目的及意義
    1.3 研究內(nèi)容及技術(shù)路線
第二章 材料與儀器
    2.1 分析軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)試劑耗材
    2.4 實(shí)驗(yàn)所需緩沖液
第三章 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 DNA聚合酶hPolη的制備
        3.1.1 HPolη的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.2 菌體裂解
        3.1.3 HPolη過Hitrap^TM FF柱純化
    3.2 DNA底物制備
        3.2.1 DNA引物合成
        3.2.2 P(32)標(biāo)記單鏈DNA
        3.2.3 制備dsDNA底物模板
    3.3 制備20%、8M尿素變性聚丙烯酰胺凝膠
    3.4 HPolη活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
    3.5 HPolη催化的全長延伸實(shí)驗(yàn)
    3.6 穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析hPolη催化單個(gè)dNTP插入實(shí)驗(yàn)
    3.7 穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)分析hPolη催化單個(gè)dNTP插入下一位的延伸實(shí)驗(yàn)
    3.8 穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析hPolη催化單個(gè)核苷酸插入的效率
        3.8.1 穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析變化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單個(gè)核苷酸的插入
        3.8.2 HPolη酶活性滴定實(shí)驗(yàn)
        3.8.3 穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析改變dNTP濃度與時(shí)間進(jìn)行單個(gè)核苷酸的插入
    3.9 表面等離子共振(SPR)檢測hPolη與不同dsDNA的結(jié)合能力
        3.9.1 分析hPolη在沒有dNTP與Mg²⁺參與條件下與DNA的結(jié)合能力
        3.9.2 分析hPolη在dTTP、dCTP和 Mg²⁺存在下與DNA的結(jié)合能力
第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 DNA聚合酶hPolη的表達(dá)純化
        4.1.1 HPolη的小量誘導(dǎo)表達(dá)
        4.1.2 HPolη的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化
    4.2 HPolη的酶活性驗(yàn)證
    4.3 DNA模板上的6mA和 I抑制聚合酶eta進(jìn)行全長延伸
    4.4 DNA模板上的6mA和 I降低單個(gè)核苷酸插入的效率
    4.5 DNA模板上的6mA和 I降低hPolη催化下一個(gè)核苷酸插入的效率
    4.6 HPolη催化單個(gè)核苷酸插入的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析
        4.6.1 穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析變化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單個(gè)核苷酸的插入
        4.6.2 模板上的6mA和 I削弱了DNA聚合酶與DNA模板的結(jié)合能力
        4.6.3 改變dNTP濃度與時(shí)間的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)分析
    4.7 DNA模板上6mA和 I降低聚合酶eta與 DNA模板的親和力
        4.7.1 HPolη在沒有dNTP和 Mg²⁺參與條件下與dsDNA的親和力
        4.7.2 HPolη在dNTP和 Mg²⁺參與條件下與dsDNA親和力
第五章 結(jié)論與討論
    5.1 結(jié)論
    5.2 討論
        5.2.1 DNA損傷降低聚合酶催化的保真性
        5.2.2 DNA損傷影響DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性
        5.2.3 DNA的甲基化修飾降低核苷酸插入效率及與蛋白酶的親和力
全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文



本文編號(hào)：3777502