雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是一類主要存在于細菌中的用于感知外界信號刺激并作出應(yīng)答的系統(tǒng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)總共200-300種不同的TCS,而一個細菌中包含約20種TCS。TCS蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相對保守,對于細菌的生長、繁殖和耐藥等生命活動至關(guān)重要,但同時卻并不存在于人類及哺乳動物細胞中,因此TCS被認為是一種潛在的新型抗菌藥物靶點。常規(guī)的一個TCS由一對蛋白質(zhì)組成,分別為組氨酸激酶(Histine kinase,HK)和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(Response Regulator,RR)。TCS系統(tǒng)通過磷酸傳遞發(fā)揮其生物學(xué)功能,即HK蛋白感知外界信號刺激后與ATP反應(yīng)并完成自磷酸化,自磷酸化完成后的HK蛋白可以將下游RR蛋白磷酸化,被磷酸化的RR蛋白會與對應(yīng)的基因相結(jié)合,并調(diào)控其表達。HK蛋白不僅可以使RR蛋白磷酸化,其同時具有將磷酸化的RR蛋白去磷酸化的功能,HK蛋白通過磷酸激酶和磷酸酶的雙功能,精準調(diào)控磷酸化RR的量,以完成對信號刺激的準確應(yīng)答。HK蛋白作為一種多功能的酶類,針對其功能的抑制劑研究相對于RR較多,...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 緒論
    1.1 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)介紹
        1.1.1 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)功能機制
        1.1.2 HK蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
            1.1.2.1 Sensor domain及transmembrane domain的結(jié)構(gòu)與功能
            1.1.2.2 Linker domain的結(jié)構(gòu)與功能
            1.1.2.3 DHp domain及CA domain的結(jié)構(gòu)與功能
        1.1.3 RR蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
            1.1.3.1 Receiver domain的結(jié)構(gòu)特點
            1.1.3.2 Effector domain的結(jié)構(gòu)特點
        1.1.4 針對TCS的抑菌劑研究進展
    1.2 木犀草素介紹
        1.2.1 木犀草素的抗氧化作用
        1.2.2 木犀草素的抗菌及消除耐藥作用
        1.2.3 木犀草素的抗炎作用
        1.2.4 木犀草素的抗腫瘤作用
        1.2.5 木犀草素的其他藥理作用
    1.3 ATP合成酶介紹
        1.3.1 F₁F_O-ATP合成酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.2 F₁F_O-ATP合成酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.3 V₁V_O-ATP合成酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.3.4 ATP合成酶特點總結(jié)
    1.4 核磁共振介紹
        1.4.1 核磁共振波譜儀的介紹
        1.4.2 常見的核磁共振觀測參數(shù)
        1.4.3 常見的核磁共振實驗
        1.4.4 常用的核磁共振基本參數(shù)
    1.5 等溫滴定量熱實驗介紹
    1.6 主要研究內(nèi)容
第2章 組氨酸激酶HK853^cp、HK853^CA等蛋白質(zhì)及突變體的表達
    2.1 前言
    2.2 試劑與儀器
        2.2.1 實驗試劑
        2.2.2 實驗儀器
    2.3 HK853^cp、HK853^CA及其突變體蛋白質(zhì)表達前準備
        2.3.1 HK853^cp、HK853^CA及其突變體的重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.2 不同突變體的引物設(shè)計
        2.3.3 PCR擴增目的片段
        2.3.4 酶切、質(zhì)粒提取及轉(zhuǎn)化
    2.4 HK853^cp、HK853^CA及其突變體的表達
        2.4.1 非標蛋白的表達
        2.4.2 ¹⁵N/¹³C單標/雙標蛋白的表達
    2.5 HK853^cp、HK853^CA以及其突變體的純化
        2.5.1 HK853^cp及其突變體的純化
        2.5.2 HK853^CA及其突變體的純化
    2.6 RR468的表達及純化
        2.6.1 RR468蛋白的表達
        2.6.2 RR468蛋白的純化
    2.7 EnvZ^cp的純化及表達
        2.7.1 EnvZ^cp蛋白的表達
        2.7.2 EnvZ^cp蛋白的純化
    2.8 結(jié)果與討論
        2.8.1 HK853^cp蛋白表達純化結(jié)果
        2.8.2 HK853^CA蛋白表達純化結(jié)果
    2.9 結(jié)論
第3章 組氨酸激酶HK853^CA的主鏈及側(cè)鏈歸屬
    3.1 前言
    3.2 試劑與儀器
        3.2.1 實驗試劑
        3.2.2 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 反應(yīng)條件
        3.3.2 NMR實驗
        3.3.3 HK853^CA的主鏈及側(cè)鏈歸屬
    3.4 結(jié)果與討論
    3.5 結(jié)論
第4章 木犀草素對HK853自磷酸化活性抑制作用機制研究
    4.1 前言
    4.2 試劑與儀器
        4.2.1 實驗試劑
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 NMR實驗方法
        4.3.2 ITC實驗方法
        4.3.3 分子模擬方法
        4.3.4 抑菌試驗方法
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 ³¹P NMR實驗結(jié)果
            4.4.1.1 ³¹P NMR分析方法的可行性分析
            4.4.1.2 ³¹P NMR分析Lut的抑制活性
        4.4.2 ITC定量分析木犀草素與HK853的親和力
        4.4.3 ¹⁵N-¹H HSQC滴定分析木犀草素對HK853^CA的影響
        4.4.4 分子模擬結(jié)果
        4.4.5 結(jié)構(gòu)類似黃酮類物質(zhì)功能驗證
        4.4.6 木犀草素等物質(zhì)的抑菌作用分析
    4.5 結(jié)論
第5章 HK853 ATP Lid對自磷酸化活性影響的研究
    5.1 前言
    5.2 試劑與儀器
        5.2.1 實驗試劑
        5.2.2 實驗儀器
    5.3 實驗方法
        5.3.1 ¹⁵N-¹H HSQC實驗方法
        5.3.2 ITC實驗方法
        5.3.3 ³¹P譜實驗方法
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 ¹⁵N-¹H HSQC實驗結(jié)果
        5.4.2 ITC定量分析突變對親和力的影響
        5.4.3 ³¹p NMR分析突變對HK853自磷酸化活性的影響
    5.5 結(jié)論
第6章 HK853的ATP合成功能的研究
    6.1 前言
    6.2 試劑與儀器
        6.2.1 實驗試劑
        6.2.2 實驗儀器
    6.3 實驗方法
        6.3.1 ³¹P譜實驗方法
        6.3.2 ¹⁵N-¹H HSQC實驗方法
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 ADP與HK853^CA反應(yīng)³¹P NMR實驗結(jié)果
        6.4.2 ¹⁵N-¹H HSQC實驗觀察ADP與HK853^CA的反應(yīng)
        6.4.3 HK853^CA和HK853^cp與ADP反應(yīng)速率對比
        6.4.4 HK853^H260A和HK853^cp與ADP反應(yīng)速率對比
        6.4.5 HK853 ATP Lid突變對HK853與ADP反應(yīng)的影響
        6.4.6 HK853^CA四種突變體(已知影響激酶功能)與ADP反應(yīng)結(jié)果
        6.4.7 HK853自磷酸化活性與ATP合成活性對比
        6.4.8 基于ADP的HK853→RR468磷酸傳遞實驗結(jié)果
        6.4.9 HK家族其他蛋白質(zhì)與ADP反應(yīng)結(jié)果
        6.4.10 HK蛋白是否是一種無差別的“磷酸鍵加工廠”?
        6.4.11 HK蛋白合成ATP機制推測
    6.5 結(jié)論
第7章 總結(jié)和展望
    7.1 總結(jié)
    7.2 展望
參考文獻
附錄A 氨基酸中英文對照表
附錄B 常用培養(yǎng)基配方及配制過程
附錄C 電泳實驗中所用到的配方及配制過程
致謝
作者簡歷及攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3765821