在植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境的過程中,存在許多信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Ca²⁺作為重要的第二信使,在植物響應(yīng)體內(nèi)外刺激,傳遞信號進而調(diào)節(jié)體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)中起到關(guān)鍵的作用。鈣離子依賴的蛋白激酶(CPKs)是植物中廣泛存在的一類鈣離子結(jié)合蛋白,參與植物生長發(fā)育,生物和非生物脅迫的調(diào)節(jié)過程,是植物鈣離子信號級聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分。本研究從水稻CPK12基因參與逆境調(diào)控和激素信號調(diào)控著手,通過反向遺傳學(xué)研究方法,構(gòu)建OsCPK12基因敲除和超表達突變體,用150 mmol/L的NaCl進行鹽脅迫處理后,超表達株系無論株高,根長還是葉片狀態(tài)都優(yōu)于野生型,而基因敲除突變體相比于野生型株高明顯矮化,根的發(fā)育形態(tài)差,葉片枯黃。證實OsCPK12對水稻耐鹽有正調(diào)控作用。用real-time PCR對突變體株系的根、葉鞘、葉片多個部位的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑基因的表達量進行分析,結(jié)果顯示,超表達株系的多個激素受體編碼基因和下游調(diào)控基因表達量顯著上調(diào),說明OsCPK12參與激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并影響水稻抗逆反應(yīng)。為進一步研究OsCPK12的基因功能,通過在水稻原生質(zhì)體中表達融合蛋白進行OsCPK12的亞細胞...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 文獻綜述
        1.2.1 CPK的發(fā)現(xiàn)和基本結(jié)構(gòu)
        1.2.2 CPKs活性調(diào)節(jié)
        1.2.3 CPKs的定位和分布
    1.3 CPKs的生物學(xué)功能
        1.3.1 CPKs參與植物對鹽脅迫和干旱的調(diào)控
        1.3.2 CPKs參與冷脅迫應(yīng)答
        1.3.3 CPKs參與ABA信號通路
        1.3.4 CPKs參與活性氧平衡調(diào)節(jié)
        1.3.5 CPKs參與植物生長發(fā)育調(diào)控
        1.3.6 CPKs參與病原菌防御活動
        1.3.7 CPKs的作用底物
        1.3.8 CPKs與其他信號通路的交叉
2 研究目的及意義
3 材料方法
    3.1 OsCPK12遺傳材料構(gòu)建
        3.1.1 基因敲除和超表達載體構(gòu)建
        3.1.2 農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化水稻
    3.2 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測
        3.2.1 基因敲除材料檢測
        3.2.2 超表達材料拷貝數(shù)檢測
    3.3 突變體鹽脅迫處理
        3.3.1 材料選取
        3.3.2 處理方法
    3.4 激素marker基因表達量分析
    3.5 蛋白亞細胞定位
    3.6 互作蛋白篩選
    3.7 雙分子熒光互補驗證蛋白互作
    3.8 熒光素酶酶活恢復(fù)驗證蛋白互作
4 實驗結(jié)果
    4.1 相關(guān)載體構(gòu)建
        4.1.1 基因敲除載體構(gòu)建
        4.1.2 超表達和酵母雙雜交載體構(gòu)建
    4.2 OsCPK12基因功能
    4.3 OsCPK12參與多個激素信號通路
    4.4 OsCPK12 的亞細胞定位
    4.5 OsCPK12的互作蛋白篩選
        4.5.1 OsCPK12自激活檢測
        4.5.2 文庫篩選和結(jié)果
        4.5.3 候選蛋白的點對點驗證
    4.6 雙分子熒光互補實驗驗證互作
    4.7 熒光素酶酶活恢復(fù)實驗驗證互作
5 討論與展望
6 參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 部分實驗操作方法
        Protocol 1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻遺傳轉(zhuǎn)化
        Protocol 2 水稻葉片DNA的抽提
        Protocol 3 Southern blot
        Protocol 4 水稻葉片RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄
        Protocol 5 高質(zhì)量質(zhì)粒抽提
        Protocol 6 水稻原生質(zhì)體抽提和轉(zhuǎn)化
        Protocol 7 酵母雙雜膜蛋白篩選
    附錄Ⅱ: 部分引物序列
致謝



本文編號：3760094