發(fā)布時(shí)間：2023-03-11 18:47

　　細(xì)菌趨化性是雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中一典型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在該途徑中,組氨酸激酶CheA自磷酸化,催化ATP的水解,并將高能磷酸基團(tuán)傳遞給CheA的同源應(yīng)答調(diào)控分子CheY。磷酸化的CheY蛋白與鞭毛馬達(dá)蛋白相互作用,引起鞭毛轉(zhuǎn)動(dòng)方向的改變,進(jìn)而改變細(xì)菌游動(dòng)的方向。細(xì)菌趨化性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)除了雙組分CheA和CheY,還需要耦合蛋白CheW和跨膜化學(xué)受體的配合。CheA的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(P5)、CheW和跨膜化學(xué)受體三者相互作用,形成非常穩(wěn)定的信號(hào)復(fù)合物。在信號(hào)復(fù)合物內(nèi),CheA的激酶活性受到調(diào)節(jié),跨膜化學(xué)受體感受到外界環(huán)境信號(hào)后,信號(hào)復(fù)合物表現(xiàn)出激酶開(kāi)或者激酶關(guān)的輸出狀態(tài),細(xì)菌的游動(dòng)行為就反應(yīng)了受體信號(hào)復(fù)合物在這兩種狀態(tài)下的比例。所以,組氨酸激酶CheA在細(xì)菌趨化性信號(hào)的融合、轉(zhuǎn)換和放大過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。盡管近些年來(lái)本研究領(lǐng)域在理解信號(hào)復(fù)合物結(jié)構(gòu)方面取得了突破,但是在這一結(jié)構(gòu)框架內(nèi)CheA激酶活性被調(diào)節(jié)的分子機(jī)制依然不清晰。前期的研究結(jié)果顯示,CheA的催化結(jié)構(gòu)域(P4)和調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域之間的域間連接,P4-P5連接,可能介導(dǎo)從P5-CheW-受體相互作用界面到催化結(jié)構(gòu)域P4的調(diào)節(jié)信號(hào)的傳遞。為了...

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要名詞縮寫(xiě)
1 引言
    1.1 研究背景
    1.2 趨化性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)蛋白
    1.3 組氨酸激酶CheA及核心信號(hào)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
    1.4 組氨酸激酶CheA活性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)用酶和實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 本項(xiàng)研究涉及的基本實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.1.1 PCR
            2.2.1.2 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
            2.2.1.3 電轉(zhuǎn)化
            2.2.1.4 化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
            2.2.1.5 化學(xué)轉(zhuǎn)化
            2.2.1.6 質(zhì)粒抽提
        2.2.2 組氨酸激酶CheA的P4-P5連接突變株的分離
            2.2.2.1 P4-P5連接突變載體的構(gòu)建
            2.2.2.2 P4-P5連接突變株的獲取
            2.2.2.3 P4-P5連接突變株的篩選及驗(yàn)證
        2.2.3 CheA蛋白的制備
            2.2.3.1 突變載體的分子構(gòu)建
            2.2.3.2 CheA蛋白表達(dá)菌株的獲得
            2.2.3.3 CheA蛋白的表達(dá)與純化
        2.2.4 CheW蛋白的制備
            2.2.4.1 CheW蛋白表達(dá)菌株的獲得和蛋白的表達(dá)
            2.2.4.2 CheW蛋白的純化
        2.2.5 CheY蛋白的制備
            2.2.5.1 CheY蛋白的表達(dá)
            2.2.5.2 CheY蛋白的純化
        2.2.6 含細(xì)胞膜的Tsr受體蛋白的制備
        2.2.7 信號(hào)復(fù)合物的體外重建
        2.2.8 Western Blot蛋白質(zhì)檢測(cè)
        2.2.9 ATP酶分析法
        2.2.10 CheA蛋白的體外激活實(shí)驗(yàn)
        2.2.11 CheA蛋白的體內(nèi)激活實(shí)驗(yàn)
    2.3 數(shù)據(jù)分析處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 連接突變株的分離
    3.2 連接突變體的細(xì)菌體內(nèi)驗(yàn)證
    3.3 連接突變CheA蛋白的體外活性
    3.4 連接突變CheA蛋白的細(xì)菌體內(nèi)趨化作用
    3.5 連接突變CheA蛋白對(duì)信號(hào)復(fù)合物的影響
    3.6 連接突變CheA蛋白的體外激活作用
    3.7 在缺少P5結(jié)構(gòu)域的情況下連接突變體的效應(yīng)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3760047