目前,聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯塑料(PET)的廣泛使用已對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染,而焚燒和化學(xué)降解等方法帶來(lái)的二次污染同樣嚴(yán)峻,因此更為溫和的生物降解為PET的回收提供了可能性。據(jù)報(bào)道來(lái)源于Ideonella sakaiensis的塑料降解酶PETase表現(xiàn)出比其他酶更高的PET水解活性。枯草芽孢桿菌是公認(rèn)的生物安全性菌株,且具有強(qiáng)大的分泌能力,是良好的異源基因表達(dá)宿主。在基因表達(dá)中,啟動(dòng)子是直接影響基因表達(dá)水平的重要基因組調(diào)控元件,而信號(hào)肽則決定了蛋白的外泌能力。所以外源基因的成功高效率表達(dá)不僅要選擇合適的宿主菌株,合適的啟動(dòng)子和信號(hào)肽同樣重要。在本研究中,我們利用枯草芽孢桿菌對(duì)PETase進(jìn)行外泌表達(dá),并選擇了5個(gè)信號(hào)肽和2個(gè)啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)PETase的胞外分泌,并以天然信號(hào)肽SPPETase作為對(duì)照。通過(guò)正交設(shè)計(jì),構(gòu)建了7株工程菌,分別是:WB600-P43-SP_AprE,WB600-P43-SP_apr,WB600-P43-SP_BprA,WB600-P43-SP_SacC,WB600-P43-SP

【文章頁(yè)數(shù)】：57 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 PET簡(jiǎn)介
        1.1.1 塑料污染
        1.1.2 PET合成
        1.1.3 PET回收處理
    1.2 PET生物降解
        1.2.1 PET生物降解簡(jiǎn)介
        1.2.2 PET降解酶
        1.2.3 新型PET降解酶PETase

    1.3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)原件
        1.3.1 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.2 啟動(dòng)子對(duì)外源基因表達(dá)影響
        1.3.3 信號(hào)肽對(duì)外源基因表達(dá)影響
    1.4 酶分子的工程改造
        1.4.1 定向進(jìn)化
        1.4.2 理性與半理性設(shè)計(jì)
    1.5 立題意義與主要研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 立題意義
        1.5.2 主要研究?jī)?nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 工具酶、引物與測(cè)序、試劑盒及試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 相關(guān)溶液
    2.2 表達(dá)載體在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中的表達(dá)純化及檢測(cè)
        2.2.1 表達(dá)載體在大腸桿菌(E.coli)TOP10 中的克隆
        2.2.2 表達(dá)載體在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)
        2.2.3 表達(dá)載體在枯草芽孢桿菌WB600中的表達(dá)
        2.2.4 表達(dá)蛋白的檢測(cè)
    2.3 酶活檢測(cè)方法
        2.3.1 p-NPP法測(cè)定蛋白質(zhì)酶活
        2.3.2 蛋白水解BHET活性檢測(cè)
    2.4 啟動(dòng)子及信號(hào)肽的篩選
        2.4.1 WB600-P43-SP_amy工程菌的構(gòu)建
        2.4.2 培養(yǎng)溫度的確定
        2.4.3 WB600-P43-SP_sp工程菌的構(gòu)建
        2.4.4 不同信號(hào)肽介導(dǎo)下PETase外泌情況
        2.4.5 WB600-Pylb-SP_amy工程菌的構(gòu)建
        2.4.6 不同啟動(dòng)子介導(dǎo)下PETase外泌情況
        2.4.7 掃描電鏡實(shí)驗(yàn)
    2.5 半理性設(shè)計(jì)提高PETase的熱穩(wěn)定性
        2.5.1 突變位點(diǎn)的選擇
        2.5.2 突變表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.5.3 大腸桿菌BL21(DE3)突變工程菌株的構(gòu)建及表達(dá)
        2.5.4 PETase及其突變體蛋白活性測(cè)定
        2.5.5 最適溫度測(cè)定
        2.5.6 熱穩(wěn)定性測(cè)定
        2.5.7 突變體rmsd、rmsf的確定及作用力的分析
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 啟動(dòng)子及信號(hào)肽篩選提高PETase在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)量
        3.1.1 PETase重組表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.1.2 工程菌培養(yǎng)溫度的測(cè)定
        3.1.3 不同信號(hào)肽對(duì)PETase分泌表達(dá)的影響
        3.1.4 不同啟動(dòng)子對(duì)PETase分泌表達(dá)的影響
        3.1.5 檢測(cè)分泌的PETase水解BHET
        3.1.6 通過(guò)分泌的PETase檢測(cè)降解的PET膜
        3.1.7 小結(jié)
    3.2 半理性設(shè)計(jì)提高PETase的熱穩(wěn)定
        3.2.1 突變位點(diǎn)的選擇
        3.2.2 突變體的構(gòu)建與表達(dá)
        3.2.3 單點(diǎn)突變體的初篩
        3.2.4 突變體酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
        3.2.5 突變體穩(wěn)定性提高的分子機(jī)制
        3.2.6 小結(jié)
第四章 主要結(jié)論與展望
    4.1 主要結(jié)論
    4.2 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄 Ⅰ:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文
附錄 Ⅱ:英文縮略表



本文編號(hào)：3749849

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