目的:制備熱穩(wěn)定性好、耐RNase攻擊及可全程監(jiān)控操作的核酸檢測(cè)新型冠狀病毒陽(yáng)性質(zhì)控品。方法:分別擴(kuò)增MS2噬菌體外殼蛋白CP（含PAC位點(diǎn)）基因以及成熟酶蛋白A基因序列（含核糖體結(jié)合位點(diǎn)）,先后插入質(zhì)粒pET28a多克隆位點(diǎn)不同位置,構(gòu)建通用重組載體pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三個(gè)靶標(biāo)的特定核酸序列,插入到重組載體pET28a/CP-A中PAC位點(diǎn)的下游,構(gòu)建包含靶序列的重組載體pET28a/CP-A/S。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白,采用硫酸銨和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,利用透射電鏡和動(dòng)態(tài)光散射對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲R(shí)NA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)其殘余核酸和熱穩(wěn)定性。結(jié)果:成功構(gòu)建包含MS2噬菌體外殼蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重組載體,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、誘導(dǎo)14h時(shí)以可溶性形式得到高效表達(dá),純化后,得到了大小均一、直徑為23～28nm的病毒樣顆粒,經(jīng)核酸酶消化后RT-PCR檢測(cè),顆粒溶液中幾乎無(wú)核酸殘余且形成了包封靶基因的盔甲R(shí)NA。加速破壞試驗(yàn)表明該盔甲R(shí)NA無(wú)菌過(guò)濾后可在37℃... 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒和主要試劑
        1.1.2 引物和探針
    1.2 方法
        1.2.1 重組載體構(gòu)建
        1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化
        1.2.3病毒樣顆粒的物理表征
        1.2.4 病毒樣顆粒殘余核酸去除
        1.2.6 病毒樣顆粒穩(wěn)定性檢測(cè)
2 結(jié)果
    2.1 重組載體的構(gòu)建
    2.2 目的蛋白的表達(dá)和純化
    2.3 病毒樣顆粒的物理表征
    2.4 病毒樣顆粒酶消化去除殘余核酸
    2.5 病毒樣顆粒核酸拷貝數(shù)確定
    2.6 病毒樣顆粒的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3732016