CRISPR/Cas9技術(shù)在目標(biāo)位點(diǎn)引入雙鏈DNA斷裂（DSBs）作為修復(fù)基因的第一步,很容易導(dǎo)致基因缺失等突變。因此,研究人員開發(fā)了一種新的基因組編輯方法-堿基編輯器。它可以直接將一個(gè)堿基或堿基對(duì)轉(zhuǎn)換成另一個(gè)堿基對(duì),從而在細(xì)胞中有效地誘導(dǎo)點(diǎn)突變,此外,CRISPR/Cas9衍生的堿基編輯也提高了修復(fù)基因組中點(diǎn)突變的效率。本課題通過將人源的胞苷脫氨酶（AID）分別替代CRISPR/Cas9蛋白中的HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC-like結(jié)構(gòu)域,重新設(shè)計(jì)一種新型的堿基編輯器,檢測(cè)這種新型堿基編輯器的堿基編輯窗口和編輯效率。首先嘗試對(duì)堿基編輯器進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn),通過將spCas9中的HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC-like結(jié)構(gòu)域分別替換為AID蛋白,獲得8種dCas9重組質(zhì)粒,然后在蛋白N端連接上UGI序列,獲得dCas9-AID蛋白;同時(shí)在體外設(shè)計(jì)出特定的的sgRNA,通過體外轉(zhuǎn)錄純化等步驟獲得100bp的sgRNA;根據(jù)sgRNA的序列設(shè)計(jì)底物DNA序列,通過PCR擴(kuò)增獲得大量的DNA片段。使用原核表達(dá)系統(tǒng)體外純化堿基編輯蛋白,將重組蛋白分別進(jìn)行GST親和層析、Ni親和層析、肝素瓊脂糖凝膠層析（Hep... 

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 課題研究的背景和意義
    1.2 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
    1.3 單堿基編輯器簡(jiǎn)介
        1.3.1 胞嘧啶堿基編輯器的發(fā)展
        1.3.2 腺嘌呤堿基編輯器的發(fā)展
    1.4 單堿基編輯器的應(yīng)用
        1.4.1 誘導(dǎo)點(diǎn)突變
        1.4.2 有絲分裂后細(xì)胞的堿基編輯
        1.4.3 堿基編輯引入終止密碼子
        1.4.4 制作模型生物
        1.4.5 作為信號(hào)記錄器
        1.4.6 植物的堿基編輯
    1.5 本課題主要研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 構(gòu)建蛋白表達(dá)載體
        1.5.2 構(gòu)建sgRNA載體
        1.5.3 體外實(shí)驗(yàn)
        1.5.4 細(xì)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)
    1.6 技術(shù)路線
第2章 材料與方法
    2.1 質(zhì)粒細(xì)胞與菌株
    2.2 蛋白表達(dá)相關(guān)材料
    2.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.3.1 克隆所需試劑
        2.3.2 蛋白表達(dá)相關(guān)試劑
        2.3.3 其他相關(guān)試劑
    2.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.5 獲取目的序列
    2.6 PCR擴(kuò)增目的基因與載體
        2.6.1 瓊脂糖凝膠電泳
        2.6.2 膠回收步驟
    2.7 酶切與連接
    2.8 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.8.1 TB法制備感受態(tài)細(xì)胞T1 的制備
    2.9 陽性克隆篩選
    2.10 重組質(zhì)粒的提取與鑒定
        2.10.1 質(zhì)粒提取步驟
    2.11 蛋白純化
    2.12 SgRNA的體外純化
        2.12.1 體外轉(zhuǎn)錄操作步驟
        2.12.2 體外純化步驟
    2.13 T7 聚合酶的提取
    2.14 底物DNA的擴(kuò)增與回收
    2.15 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
    2.16 處理細(xì)胞
    2.17 蛋白免疫印跡(Western Bloting)
    2.18 提取基因組
第3章 堿基編輯器體外功能測(cè)定
    3.1 體外重組質(zhì)粒的構(gòu)建
    3.2 體外sgRNA和底物DNA表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.3 融合蛋白的表達(dá)與純化
        3.3.1 DE-HNH-dCas9 融合蛋白肝素瓊脂糖凝膠層析
        3.3.2 DE-HNH-dCas9 融合蛋白過S柱
        3.3.3 DE-REC-dCas9 融合蛋白過Heparin柱
        3.3.4 不同處理方法純化DE-REC-dCas9-S-A融合蛋白
        3.3.5 不同感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)DE-REC-dCas9-S-A-S融合蛋白
    3.4 Wb檢測(cè)蛋白表達(dá)
    3.5 本章小結(jié)
第4章 堿基編輯器細(xì)胞內(nèi)功能測(cè)定
    4.1 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建
    4.2 檢測(cè)堿基編輯器的功能
        4.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)
        4.2.2 WB檢測(cè)蛋白表達(dá)
        4.2.3 檢測(cè)蛋白的細(xì)胞內(nèi)編輯效率
    4.3 本章小結(jié)
    4.4 討論
結(jié)論
展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3729979