目的:實(shí)現(xiàn)梅花鹿基質(zhì)金屬蛋白酶-2催化域（Catalytic domain of matrix metalloprotease2,cdMMP-2）的體外表達(dá),為進(jìn)一步研究基質(zhì)金屬蛋白酶-2催化域結(jié)構(gòu)功能及產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法:采用RT-PCR方法從鹿茸cDNA中擴(kuò)增MMP-2的催化域基因,運(yùn)用Nde I和Not I克隆位點(diǎn)連入原核表達(dá)載體pET30a中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,利用IPTG引導(dǎo)目的蛋白表達(dá),通過使用金屬螯合層析技術(shù)和柱上復(fù)性方法來純化和復(fù)性目的蛋白,利用酶解底物法檢測酶的活性。結(jié)果:1.重組表達(dá)的cdMMP-2 C端帶有6×His標(biāo)簽,共有377個(gè)氨基酸,預(yù)測大小為42.04kD,理論等電點(diǎn)為4.95;2.cdMMP-2轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中并成功表達(dá)cdMMP-2蛋白,優(yōu)化出最佳IPTG濃度為0.6 mM,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5 h;3.經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測和免疫印跡分析,發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要表達(dá)在包涵體中。使用金屬螯合層析技術(shù)純化目的蛋白,柱上復(fù)性后由SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果顯示目的蛋白單一條帶;5.測得蛋白濃度為2.0 mg/m... 

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略語
引言
文獻(xiàn)綜述
實(shí)驗(yàn)研究
    第一章 MMP-2催化域基因的擴(kuò)增和cdMMP-2的構(gòu)建
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    第二章 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)條件優(yōu)化
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    第三章 蛋白純化及復(fù)性
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
    第四章 蛋白含量測定及底物酶解實(shí)驗(yàn)
        1 實(shí)驗(yàn)材料
        2 實(shí)驗(yàn)方法
        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4 討論
        5 小結(jié)
結(jié)論
本文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
在學(xué)期間主要研究成果
個(gè)人簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]MMP-1,2與甲狀腺癌現(xiàn)狀[J]. 吳小雨,張曼旭,萬智恒.  內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志. 2019(01)
[2]MMP-2及其抑制物TIMP-1在膀胱癌中的表達(dá)及意義[J]. 蔣東鵬,曾憲輝,孫軼君,管德輝.  世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘. 2019(05)
[3]MMP-2與NF-KB在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用[J]. 劉敏.  實(shí)用癌癥雜志. 2018(08)
[4]MMP-2/9和Ⅳ型膠原蛋白與胃癌患者胃液芳香族氨基酸濃度變化的關(guān)系[J]. 劉健,周麗雅,崔榮麗,金珠,林三仁,張賀軍,韓亞京,張穎,尚惠茹,李松茹.  中國微創(chuàng)外科雜志. 2018(06)
[5]鹿產(chǎn)品鑒別的研究進(jìn)展[J]. 董世武,王磊,周永娜,邢秀梅.  經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報(bào). 2018(04)
[6]重組大腸桿菌表達(dá)外源蛋白包涵體復(fù)性的研究進(jìn)展[J]. 牟筱,宗惠,宮皓,楊焱,余四九.  甘肅畜牧獸醫(yī). 2018(04)
[7]鹿茸的化學(xué)成分及質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展[J]. 郭曉晗,程顯隆,李明華,張文娟,魏鋒,馬雙成.  藥物分析雜志. 2018(04)
[8]梅花鹿鹿筋膠原蛋白提取工藝研究[J]. 陳海燕,王華笑,楊傲,張學(xué)文,劉悅.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2017(19)
[9]酸法和酶法提取牦牛骨膠原蛋白的特性分析[J]. 王曉軍,吳婷,賈偉,張春暉,韓玲,余群力.  食品科學(xué). 2018(12)
[10]鹿茸膠原多肽復(fù)合酶水解工藝研究[J]. 李冰,李梁,王露露,董思敏,黃寶亮,張晶.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016(11)



本文編號：3717079