ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine,簡寫ε-PL）是由25-35個L-賴氨酸通過α-羧基和ε-氨基縮合而成的一種同型氨基酸聚合物,主要由鏈霉菌屬微生物經(jīng)好氧發(fā)酵產(chǎn)生并在胞外積累。由于ε-PL具有廣譜的抑菌活性和較高的食品安全性,目前被用作一種新型生物食品防腐劑,在日本、韓國、美國和中國的食品工業(yè)中獲得批準使用。此外,ε-PL作為一種安全且環(huán)境友好的生物聚合物,在生物醫(yī)藥領域也有著廣泛應用前景。因此,ε-PL是一種具有廣泛應用領域和巨大市場價值的新型生物技術產(chǎn)品。論文以一株ε-PL工業(yè)生產(chǎn)菌株Streptomyces albulus M-Z18為研究對象,通過建立低pH沖擊兩階段發(fā)酵策略,顯著提高了低p H沖擊工藝的ε-PL發(fā)酵效率;從生理水平和基因轉錄水平系統(tǒng)探究了低pH沖擊對S.albulus M-Z18產(chǎn)生的影響;同時,通過基因失活、回補和過表達等分子操作,研究了S.albulus M-Z18響應低p H沖擊的雙組分系統(tǒng)MprAB的生理功能;最后,系統(tǒng)研究了S.albulus M-Z18耐受低pH環(huán)境脅迫的生理機制,并發(fā)現(xiàn)尿素酶系統(tǒng)在S.albulus M-Z18抵御低p... 

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 概述
        1.1.1 ε-聚賴氨酸的簡介
        1.1.2 ε-聚賴氨酸的性質
        1.1.3 ε-聚賴氨酸的應用
    1.2 ε-聚賴氨酸生物合成與pH值的關系
    1.3 環(huán)境脅迫
        1.3.1 pH沖擊
        1.3.2 pH沖擊在微生物發(fā)酵中的應用
    1.4 微生物響應pH沖擊的研究進展
        1.4.1 微生物在形態(tài)方面對pH沖擊的響應
        1.4.2 微生物在生理方面對pH沖擊的響應
        1.4.3 微生物在信號轉導方面對pH沖擊的響應
    1.5 微生物耐酸機制研究進展
        1.5.1 胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)
        1.5.2 細胞膜的改變
        1.5.3 代謝調(diào)控
        1.5.4 保護與大分子修復
    1.6 本論文主要研究內(nèi)容
        1.6.1 立題依據(jù)和研究意義
        1.6.2 本論文主要研究內(nèi)容
第二章 基于葡萄糖為碳源的低pH沖擊工藝優(yōu)化
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 菌株
        2.2.2 主要試劑和儀器
        2.2.3 培養(yǎng)基
        2.2.4 培養(yǎng)與發(fā)酵方法
        2.2.5 分析方法
        2.2.6 pH沖擊后菌體的高產(chǎn)遺傳特性研究
        2.2.7 顯著性分析
    2.3 結果與討論
        2.3.1 以葡萄糖為碳源的低pH沖擊策略發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL
        2.3.2 兩階段低pH沖擊發(fā)酵條件優(yōu)化
        2.3.3 低pH沖擊種子培養(yǎng)的發(fā)酵工藝下補料分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL
        2.3.5 pH沖擊后菌體的高產(chǎn)遺傳特性考察
    2.4 本章小結
第三章 小白鏈霉菌在生理水平響應低pH沖擊的研究
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 菌株
        3.2.2 培養(yǎng)基
        3.2.3 培養(yǎng)條件
        3.2.4 主要儀器
        3.2.5 分析方法
        3.2.6 pH沖擊后菌體的耐酸能力驗證
        3.2.7 Pls酶活測定
        3.2.8 胞內(nèi)游離氨基酸測定
        3.2.9 細胞呼吸活力測定
        3.2.10 細胞膜脂肪酸成分分析
        3.2.11 蛋白濃度的測定
        3.2.12 統(tǒng)計學分析
    3.3 結果與討論
        3.3.1 低pH沖擊對小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的影響
        3.3.2 低pH沖擊對小白鏈霉菌耐酸能力的影響
        3.3.3 低pH沖擊對小白鏈霉菌細胞膜脂肪酸成分的影響
        3.3.4 低pH沖擊對小白鏈霉菌ε-PL合成酶酶活的影響
        3.3.5 低pH沖擊對小白鏈霉菌呼吸活力的影響
        3.3.6 低pH沖擊對小白鏈霉菌胞內(nèi)ATP積累量的影響
        3.3.7 低pH沖擊對小白鏈霉菌胞內(nèi)L-賴氨酸積累的影響
        3.3.8 低pH沖擊對小白鏈霉菌細胞內(nèi)活性氧以及丙二醛的影響
    3.4 本章小結
第四章 小白鏈霉菌在轉錄水平響應低pH沖擊的研究
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌株
        4.2.2 培養(yǎng)基
        4.2.3 培養(yǎng)條件
        4.2.4 RNA-Seq樣品制備
        4.2.5 轉錄組測序實驗步驟
        4.2.6 轉錄組信息分析流程
        4.2.7 基因差異表達篩選
        4.2.8 差異表達基因(DEGs)Gene Ontology(GO)富集分析以及KEGG富集分析
        4.2.9 總RNA提取質量
        4.2.10 RNA-seq質量評估
        4.2.11 q RT-PCR
    4.3 結果與討論
        4.3.1 差異表達基因的整體分析
        4.3.2 顯著差異表達基因的功能分類分析
        4.3.3 顯著差異表達基因的代謝途徑富集分類分析
        4.3.4 關鍵顯著差異基因的q RT-PCR分析
    4.4 本章小結
第五章 小白鏈霉菌響應低pH沖擊的信號轉導途徑研究
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 菌株和質粒
        5.2.2 主要試劑和儀器
        5.2.3 培養(yǎng)基
        5.2.4 培養(yǎng)條件
        5.2.5 質粒構建
        5.2.6 大腸桿菌相關基因克隆實驗技術
        5.2.7 鏈霉菌遺傳操作實驗技術
        5.2.8 搖瓶發(fā)酵參數(shù)測定
    5.3 結果與討論
        5.3.1 信號轉導系統(tǒng)相關顯著差異基因的分析
        5.3.2 信號轉導系統(tǒng)相關基因的插入失活菌株構建與發(fā)酵結果分析
        5.3.3 回補菌株構建與發(fā)酵結果分析
        5.3.4 過表達菌株的構建及發(fā)酵實驗
        5.3.5 mpr A、mpr B和 pep D之間調(diào)控關系
    5.4 本章小結
第六章 小白鏈霉菌耐受低pH的生理機制研究
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 菌株和質粒
        6.2.2 主要試劑和儀器
        6.2.3 培養(yǎng)基
        6.2.4 培養(yǎng)條件
        6.2.5 生理參數(shù)測定
        6.2.6 質粒的構建
        6.2.7 大腸桿菌相關基因克隆實驗技術
        6.2.8 鏈霉菌遺傳操作實驗技術
        6.2.9 突變株耐酸能力驗證
        6.2.10 搖瓶以及分批發(fā)酵參數(shù)測定
    6.3 結果與討論
        6.3.1 S.albulus M-Z18 耐受低p H值的范圍
        6.3.2 S.albulus M-Z18 在胞內(nèi)微環(huán)境水平響應低p H脅迫
        6.3.3 S.albulus M-Z18 在基因轉錄水平響應低p H脅迫
        6.3.4 維持S.albulus M-Z18 胞內(nèi)p H穩(wěn)態(tài)的系統(tǒng)鑒定
    6.4 本章小結
主要結論與展望
    主要結論
    展望
論文主要創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄一 :作者在攻讀博士學位期間發(fā)表的論文
附錄二 :qRT-PCR中相關基因序列


【參考文獻】：
期刊論文
[1]武夷菌素產(chǎn)生菌CK-15遺傳操作系統(tǒng)的優(yōu)化[J]. 劉艷,葛蓓孛,劉炳花,趙文珺,張克誠.  中國生物防治學報. 2016(04)
[2]基于pH調(diào)節(jié)和有機氮源流加調(diào)控補料分批發(fā)酵過程提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量[J]. 孫啟星,陳旭升,任喜東,鄭根成,毛忠貴.  生物工程學報. 2015(05)
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博士論文
[1]小白鏈霉菌同步代謝葡萄糖和甘油合成ε-聚賴氨酸的生理機制研究[D]. 曾昕.江南大學 2016
[2]小白鏈霉菌響應酸性pH高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的生理解析[D]. 任喜東.江南大學 2015
[3]光滑球擬酵母中ATP的生理功能與作用機制[D]. 周景文.江南大學 2009

碩士論文
[1]小白鏈霉菌響應低pH脅迫生理機制的初步解析[D]. 王開方.江南大學 2019
[2]利迪鏈霉菌A02高產(chǎn)納他霉素工程菌的選育[D]. 劉慧.河南師范大學 2014
[3]海洋鏈霉菌遺傳轉化系統(tǒng)及次級代謝產(chǎn)物的基因篩選[D]. 黃忠瑤.南京農(nóng)業(yè)大學 2014
[4]吸水鏈霉菌5008雙組分信號轉導系統(tǒng)的初步研究[D]. 徐西兵.山東大學 2012



本文編號：3716393