自然界中當(dāng)細(xì)菌面臨脅迫環(huán)境時(shí),進(jìn)入一種稱為非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC:viable but non-culturable）,這種狀態(tài)導(dǎo)致我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中分離出來(lái)的菌株只占環(huán)境的0.01%-4%。復(fù)蘇促進(jìn)因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是一種有促進(jìn)細(xì)菌復(fù)蘇作用的蛋白質(zhì),在很低的濃度可以促進(jìn)非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌復(fù)蘇,對(duì)正常生長(zhǎng)的細(xì)菌也具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。編碼復(fù)蘇促進(jìn)因子基因的片段廣泛在放線菌中存在。在紅樹(shù)林中,有豐富的放線菌資源,并且具有酶活性、抗腫瘤活性、抗病毒活性以及對(duì)一些病原菌和線蟲(chóng)有拮抗作用等多種生物活性。為了發(fā)掘紅樹(shù)林中更多的放線菌資源,本文對(duì)放線菌的rpf基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)、及對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)。從紅樹(shù)林來(lái)源的根際土壤樣品經(jīng)過(guò)排重后,分離出42株放線菌,16S rRNA基因擴(kuò)增及鑒定結(jié)果表明42株放線菌分別屬于放線菌綱下的5個(gè)目6個(gè)科8個(gè)屬。這五個(gè)目分別是微球菌亞目（Micrococcineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycetales）、小單孢菌亞目（Micromonosporineae）、棒桿菌亞目（Corynebacteri... 

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 紅樹(shù)林放線菌多樣性
        1.1.1 紅樹(shù)林的分布
        1.1.2 紅樹(shù)林根際土壤的放線菌的多樣性
        1.1.3 紅樹(shù)林放線菌的新類(lèi)群
        1.1.4 來(lái)源于紅樹(shù)林的放線菌的生物活性
        1.1.5 紅樹(shù)林放線菌資源的利用
    1.2 非可培養(yǎng)狀態(tài)的形成和復(fù)蘇
        1.2.1 VBNC誘導(dǎo)因素和形態(tài)
        1.2.2 VBNC狀態(tài)與其他一些細(xì)胞狀態(tài)的區(qū)別
        1.2.3 VBNC狀態(tài)的復(fù)蘇
        1.2.4 VBNC狀態(tài)的檢測(cè)
    1.3 Rpf的研究進(jìn)展
        1.3.1 Rpf的發(fā)現(xiàn)
            1.3.1.1 分枝桿菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
            1.3.1.2 紅平紅球菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
            1.3.1.3 放線菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
        1.3.2 Rpf的生物學(xué)特征
        1.3.3 Rpf的作用機(jī)制
        1.3.4 Rpf的應(yīng)用
    1.4 課題研究的目的及意義
第二章 紅樹(shù)林放線菌多樣性及其酶活性檢測(cè)
    2.1 引言
    2.2 主要材料
        2.2.1 土壤樣品
        2.2.2 培養(yǎng)基
    2.3 主要試劑和儀器
        2.3.1 主要試劑
        2.3.2 緩沖溶液
        2.3.3 主要儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 土壤樣品的處理
        2.4.2 放線菌的分離純化、保藏
        2.4.3 放線菌DNA的提取
            2.4.3.1 chelex法提取細(xì)菌DNA
            2.4.3.2 酶解法小量提取放線菌DNA
        2.4.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及鑒定
        2.4.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建
        2.4.6 放線菌酶活性檢測(cè)
    2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.5.1 放線菌的多樣性
        2.5.2 潛在新種
        2.5.3 放線菌的活性多樣性
    2.6 討論
第三章 放線菌Rpf生物信息分析及其克隆表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 主要材料和儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基及其他試劑
            3.1.2.1 培養(yǎng)基
            3.1.2.2 主要試劑
            3.1.2.3 緩沖溶液
        3.1.3 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.3.2 rpf基因的篩選
        3.3.3 生物信息學(xué)分析
        3.3.4 放線菌rpf-3 基因克隆載體的構(gòu)建與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.3.4.1 P_(easy)-T1-rpf-3克隆載體的構(gòu)建
            3.3.4.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.3.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.3.5 pET28a-rpf-3表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.5.1 質(zhì)粒的提取
            3.3.5.2 pET28a+的雙酶切
            3.3.5.3 pET28a-rpf-3表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 基因篩選結(jié)果
        3.4.2 生物信息分析
            3.4.2.1 放線菌Rpf理化性質(zhì)及疏水性分析
            3.4.2.2 放線菌Rpf蛋白的信號(hào)肽與磷酸位點(diǎn)的分析
            3.4.2.3 放線菌Rpf蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析
            3.4.2.4 放線菌Rpf物種間同源性分析和蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
            3.4.2.5 放線菌Rpf蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        3.4.3 P_(easy)-T1-rpfs克隆載體的構(gòu)建
        3.4.4 pET28a-rpf-3 重組原核表達(dá)載體的鑒定
    3.5 討論
第四章 放線菌Rpf重組蛋白的表達(dá)與純化及活性檢測(cè)
    4.1 主要材料和試劑
        4.1.1 培養(yǎng)基
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 緩沖溶液
        4.1.4 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)與純化
            4.3.1.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)
            4.3.1.2 SDS-PAGE的制備
            4.3.1.3 蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)
            4.3.1.4 鎳柱的裝填
            4.3.1.5 蛋白的純化
        4.3.2 重組蛋白對(duì)藤黃微球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用
            4.3.2.1 藤黃微球菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)
            4.3.2.2 Rpf蛋白對(duì)VBNC狀態(tài)菌體的復(fù)蘇作用
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 重組蛋白的表達(dá)
        4.4.2 蛋白純化結(jié)果
        4.4.3 重組蛋白對(duì)藤黃微球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用
    4.5 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)期期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]紅平紅球菌復(fù)蘇促進(jìn)因子基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究[D]. 岳靚.蘭州理工大學(xué) 2017
[2]廣西北侖河口紅樹(shù)林根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[D]. 吳越.桂林醫(yī)學(xué)院 2017
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