自然界中當(dāng)細(xì)菌面臨脅迫環(huán)境時(shí),進(jìn)入一種稱為非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC:viable but non-culturable）,這種狀態(tài)導(dǎo)致我們在實(shí)驗(yàn)室中分離出來的菌株只占環(huán)境的0.01%-4%。復(fù)蘇促進(jìn)因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是一種有促進(jìn)細(xì)菌復(fù)蘇作用的蛋白質(zhì),在很低的濃度可以促進(jìn)非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌復(fù)蘇,對正常生長的細(xì)菌也具有促進(jìn)生長的作用。編碼復(fù)蘇促進(jìn)因子基因的片段廣泛在放線菌中存在。在紅樹林中,有豐富的放線菌資源,并且具有酶活性、抗腫瘤活性、抗病毒活性以及對一些病原菌和線蟲有拮抗作用等多種生物活性。為了發(fā)掘紅樹林中更多的放線菌資源,本文對放線菌的rpf基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)、及對表達(dá)蛋白進(jìn)行活性檢測。從紅樹林來源的根際土壤樣品經(jīng)過排重后,分離出42株放線菌,16S rRNA基因擴(kuò)增及鑒定結(jié)果表明42株放線菌分別屬于放線菌綱下的5個(gè)目6個(gè)科8個(gè)屬。這五個(gè)目分別是微球菌亞目（Micrococcineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycetales）、小單孢菌亞目（Micromonosporineae）、棒桿菌亞目（Corynebacteri... 

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 紅樹林放線菌多樣性
        1.1.1 紅樹林的分布
        1.1.2 紅樹林根際土壤的放線菌的多樣性
        1.1.3 紅樹林放線菌的新類群
        1.1.4 來源于紅樹林的放線菌的生物活性
        1.1.5 紅樹林放線菌資源的利用
    1.2 非可培養(yǎng)狀態(tài)的形成和復(fù)蘇
        1.2.1 VBNC誘導(dǎo)因素和形態(tài)
        1.2.2 VBNC狀態(tài)與其他一些細(xì)胞狀態(tài)的區(qū)別
        1.2.3 VBNC狀態(tài)的復(fù)蘇
        1.2.4 VBNC狀態(tài)的檢測
    1.3 Rpf的研究進(jìn)展
        1.3.1 Rpf的發(fā)現(xiàn)
            1.3.1.1 分枝桿菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
            1.3.1.2 紅平紅球菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
            1.3.1.3 放線菌的復(fù)蘇促進(jìn)因子
        1.3.2 Rpf的生物學(xué)特征
        1.3.3 Rpf的作用機(jī)制
        1.3.4 Rpf的應(yīng)用
    1.4 課題研究的目的及意義
第二章 紅樹林放線菌多樣性及其酶活性檢測
    2.1 引言
    2.2 主要材料
        2.2.1 土壤樣品
        2.2.2 培養(yǎng)基
    2.3 主要試劑和儀器
        2.3.1 主要試劑
        2.3.2 緩沖溶液
        2.3.3 主要儀器
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 土壤樣品的處理
        2.4.2 放線菌的分離純化、保藏
        2.4.3 放線菌DNA的提取
            2.4.3.1 chelex法提取細(xì)菌DNA
            2.4.3.2 酶解法小量提取放線菌DNA
        2.4.4 16S rRNA基因擴(kuò)增及鑒定
        2.4.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
        2.4.6 放線菌酶活性檢測
    2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.5.1 放線菌的多樣性
        2.5.2 潛在新種
        2.5.3 放線菌的活性多樣性
    2.6 討論
第三章 放線菌Rpf生物信息分析及其克隆表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 主要材料和儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基及其他試劑
            3.1.2.1 培養(yǎng)基
            3.1.2.2 主要試劑
            3.1.2.3 緩沖溶液
        3.1.3 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.3.2 rpf基因的篩選
        3.3.3 生物信息學(xué)分析
        3.3.4 放線菌rpf-3 基因克隆載體的構(gòu)建與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.3.4.1 P_(easy)-T1-rpf-3克隆載體的構(gòu)建
            3.3.4.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.3.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.3.5 pET28a-rpf-3表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.5.1 質(zhì)粒的提取
            3.3.5.2 pET28a+的雙酶切
            3.3.5.3 pET28a-rpf-3表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1 基因篩選結(jié)果
        3.4.2 生物信息分析
            3.4.2.1 放線菌Rpf理化性質(zhì)及疏水性分析
            3.4.2.2 放線菌Rpf蛋白的信號肽與磷酸位點(diǎn)的分析
            3.4.2.3 放線菌Rpf蛋白二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析
            3.4.2.4 放線菌Rpf物種間同源性分析和蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹
            3.4.2.5 放線菌Rpf蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.4.3 P_(easy)-T1-rpfs克隆載體的構(gòu)建
        3.4.4 pET28a-rpf-3 重組原核表達(dá)載體的鑒定
    3.5 討論
第四章 放線菌Rpf重組蛋白的表達(dá)與純化及活性檢測
    4.1 主要材料和試劑
        4.1.1 培養(yǎng)基
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 緩沖溶液
        4.1.4 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)與純化
            4.3.1.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)
            4.3.1.2 SDS-PAGE的制備
            4.3.1.3 蛋白的SDS-PAGE檢測
            4.3.1.4 鎳柱的裝填
            4.3.1.5 蛋白的純化
        4.3.2 重組蛋白對藤黃微球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用
            4.3.2.1 藤黃微球菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)
            4.3.2.2 Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)菌體的復(fù)蘇作用
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 重組蛋白的表達(dá)
        4.4.2 蛋白純化結(jié)果
        4.4.3 重組蛋白對藤黃微球菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用
    4.5 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)期期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[J]. 葉景靜,鄭紅蕓,吳越,蔣蓮秀,陳建宏,黃庶識,黃大林.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(11)
[2]海南三亞紅樹林放線菌多樣性及抗菌活性[J]. 馮玲玲,楊芹,張露,崔艷陽,孫青青,謝則平,郭琳,張淑敏.  中國抗生素雜志. 2018(11)
[3]廣西北侖河口紅樹林植物根際淤泥放線菌的分離、鑒定、多樣性及抗菌活性研究[J]. 陳建宏,吳越,蔣蓮秀,鄭紅蕓,吳丹,何義,黃大林.  中國抗生素雜志. 2018(08)
[4]抗生素規(guī)范用藥干預(yù)對病原菌耐藥性的觀察[J]. 陳惠霞.  北方藥學(xué). 2018(06)
[5]中國紅樹林濕地:分布、種類組成及其保護(hù)[J]. 楊盛昌,陸文勛,鄒禎,李思.  亞熱帶植物科學(xué). 2017(04)
[6]微生物VBNC狀態(tài)形成及復(fù)蘇機(jī)制[J]. 張碩,丁林賢,蘇曉梅.  微生物學(xué)報(bào). 2018(08)
[7]神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)院感染病原菌分布及抗生素不合理使用情況調(diào)查[J]. 黃玉萍,楊麗華,柯玲珍,劉素芝,倪紅,張玲玲.  中華全科醫(yī)學(xué). 2017(08)
[8]廣西北侖河口紅樹林植物根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[J]. 吳越,李小俊,陳建宏,蔣蓮秀,何玉林,韋晗寧,喬永超,何義,鄭紅蕓,孫承航,黃大林.  中國抗生素雜志. 2017(04)
[9]茅尾海紅樹林土壤可培養(yǎng)放線菌多樣性及其抗尖孢鐮刀菌活性分析[J]. 吳家法,吳思婷,李智鳴,肖尚榮,吳霜,張政,楊立芳,龍寒,禤金彩,姜明國.  中國抗生素雜志. 2017(04)
[10]一株產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選鑒定及酶學(xué)特性研究[J]. 萬文結(jié),薛芷筠,張澤文,李曉華,程國軍,何冬蘭.  微生物學(xué)報(bào). 2017(05)

博士論文
[1]八門灣紅樹林土壤微生物多樣性分析及放線菌的分離與鑒定[D]. 周秋平.海南大學(xué) 2014
[2]五株海洋來源放線菌次級代謝產(chǎn)物及其活性研究[D]. 車茜.中國海洋大學(xué) 2013

碩士論文
[1]紅平紅球菌復(fù)蘇促進(jìn)因子基因克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性研究[D]. 岳靚.蘭州理工大學(xué) 2017
[2]廣西北侖河口紅樹林根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[D]. 吳越.桂林醫(yī)學(xué)院 2017
[3]福建省紅樹林稀有放線菌的多樣性及篩選[D]. 王麗.福建醫(yī)科大學(xué) 2015
[4]幾種常見致病菌的活的非可培養(yǎng)狀態(tài)研究[D]. 杜萌.中國海洋大學(xué) 2007



本文編號：3709293