自然界中當細菌面臨脅迫環(huán)境時,進入一種稱為非可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC:viable but non-culturable）,這種狀態(tài)導致我們在實驗室中分離出來的菌株只占環(huán)境的0.01%-4%。復蘇促進因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是一種有促進細菌復蘇作用的蛋白質(zhì),在很低的濃度可以促進非可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌復蘇,對正常生長的細菌也具有促進生長的作用。編碼復蘇促進因子基因的片段廣泛在放線菌中存在。在紅樹林中,有豐富的放線菌資源,并且具有酶活性、抗腫瘤活性、抗病毒活性以及對一些病原菌和線蟲有拮抗作用等多種生物活性。為了發(fā)掘紅樹林中更多的放線菌資源,本文對放線菌的rpf基因進行了克隆、表達、及對表達蛋白進行活性檢測。從紅樹林來源的根際土壤樣品經(jīng)過排重后,分離出42株放線菌,16S rRNA基因擴增及鑒定結果表明42株放線菌分別屬于放線菌綱下的5個目6個科8個屬。這五個目分別是微球菌亞目（Micrococcineae）、鏈霉菌亞目（Streptomycetales）、小單孢菌亞目（Micromonosporineae）、棒桿菌亞目（Corynebacteri... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 紅樹林放線菌多樣性
        1.1.1 紅樹林的分布
        1.1.2 紅樹林根際土壤的放線菌的多樣性
        1.1.3 紅樹林放線菌的新類群
        1.1.4 來源于紅樹林的放線菌的生物活性
        1.1.5 紅樹林放線菌資源的利用
    1.2 非可培養(yǎng)狀態(tài)的形成和復蘇
        1.2.1 VBNC誘導因素和形態(tài)
        1.2.2 VBNC狀態(tài)與其他一些細胞狀態(tài)的區(qū)別
        1.2.3 VBNC狀態(tài)的復蘇
        1.2.4 VBNC狀態(tài)的檢測
    1.3 Rpf的研究進展
        1.3.1 Rpf的發(fā)現(xiàn)
            1.3.1.1 分枝桿菌的復蘇促進因子
            1.3.1.2 紅平紅球菌的復蘇促進因子
            1.3.1.3 放線菌的復蘇促進因子
        1.3.2 Rpf的生物學特征
        1.3.3 Rpf的作用機制
        1.3.4 Rpf的應用
    1.4 課題研究的目的及意義
第二章 紅樹林放線菌多樣性及其酶活性檢測
    2.1 引言
    2.2 主要材料
        2.2.1 土壤樣品
        2.2.2 培養(yǎng)基
    2.3 主要試劑和儀器
        2.3.1 主要試劑
        2.3.2 緩沖溶液
        2.3.3 主要儀器
    2.4 實驗方法
        2.4.1 土壤樣品的處理
        2.4.2 放線菌的分離純化、保藏
        2.4.3 放線菌DNA的提取
            2.4.3.1 chelex法提取細菌DNA
            2.4.3.2 酶解法小量提取放線菌DNA
        2.4.4 16S rRNA基因擴增及鑒定
        2.4.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建
        2.4.6 放線菌酶活性檢測
    2.5 實驗結果
        2.5.1 放線菌的多樣性
        2.5.2 潛在新種
        2.5.3 放線菌的活性多樣性
    2.6 討論
第三章 放線菌Rpf生物信息分析及其克隆表達載體的構建
    3.1 主要材料和儀器
        3.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基及其他試劑
            3.1.2.1 培養(yǎng)基
            3.1.2.2 主要試劑
            3.1.2.3 緩沖溶液
        3.1.3 主要儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 引物的設計與合成
        3.3.2 rpf基因的篩選
        3.3.3 生物信息學分析
        3.3.4 放線菌rpf-3 基因克隆載體的構建與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.3.4.1 P_(easy)-T1-rpf-3克隆載體的構建
            3.3.4.2 感受態(tài)細胞的制備
            3.3.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.3.5 pET28a-rpf-3表達載體的構建
            3.3.5.1 質(zhì)粒的提取
            3.3.5.2 pET28a+的雙酶切
            3.3.5.3 pET28a-rpf-3表達載體的構建
    3.4 實驗結果
        3.4.1 基因篩選結果
        3.4.2 生物信息分析
            3.4.2.1 放線菌Rpf理化性質(zhì)及疏水性分析
            3.4.2.2 放線菌Rpf蛋白的信號肽與磷酸位點的分析
            3.4.2.3 放線菌Rpf蛋白二級結構及結構域分析
            3.4.2.4 放線菌Rpf物種間同源性分析和蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹
            3.4.2.5 放線菌Rpf蛋白的三級結構預測
        3.4.3 P_(easy)-T1-rpfs克隆載體的構建
        3.4.4 pET28a-rpf-3 重組原核表達載體的鑒定
    3.5 討論
第四章 放線菌Rpf重組蛋白的表達與純化及活性檢測
    4.1 主要材料和試劑
        4.1.1 培養(yǎng)基
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 緩沖溶液
        4.1.4 主要儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達與純化
            4.3.1.1 重組基因在大腸桿菌中的蛋白表達
            4.3.1.2 SDS-PAGE的制備
            4.3.1.3 蛋白的SDS-PAGE檢測
            4.3.1.4 鎳柱的裝填
            4.3.1.5 蛋白的純化
        4.3.2 重組蛋白對藤黃微球菌的復蘇促進作用
            4.3.2.1 藤黃微球菌VBNC狀態(tài)誘導
            4.3.2.2 Rpf蛋白對VBNC狀態(tài)菌體的復蘇作用
    4.4 實驗結果
        4.4.1 重組蛋白的表達
        4.4.2 蛋白純化結果
        4.4.3 重組蛋白對藤黃微球菌的復蘇促進作用
    4.5 討論
第五章 結論
參考文獻
致謝
攻讀學期期間發(fā)表的學術論文目錄


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3709293