發(fā)布時間：2022-12-04 02:13

　　分子伴侶是一類高度保守的蛋白質(zhì),在細胞內(nèi)有高水平的表達,在蛋白質(zhì)的折疊、裝配、運輸以及降解等過程中發(fā)揮著決定性的作用,并能夠有效保護蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)。D-氨基�；福―-aminoacylase）是一類能特異性水解N-�；�-D-氨基酸獲得高純度的水解酶。本研究以來源于M.natoriense TNJL143-2中D-氨基�；窪AA（1488 bp）編碼的基因（DAA片段）在大腸桿菌JM109中表達的酶（JM109-pUC19-DAA）作為研究對象,研究分子伴侶CpkA對D-氨基�；福―-aminoacylase）活性影響。表達鑒定結(jié)果顯示各突變酶均為可溶性蛋白,活性鑒定結(jié)果顯示:與M.natoriense143-2活性對比,突變酶的活性降低了0.15～0.33倍;與JM109-pUC19-DAA活性對比,V125L突變酶的活性提高了1.66倍。各突變酶與分子伴侶DE3-pET21a-CpkA共表達后,與M.natoriense TNJL143-2活性對比,JM109-pUC19-DAA與各突變酶的活性提高了1.95～3.37倍;與JM109-pUC19-DAA對比,各突變酶的活性提高... 

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 D-氨基酸
        1.1.1 D-氨基酸概念
        1.1.2 存在于微生物、動物、植物、人體中的D-氨基酸
        1.1.3 D-氨基酸的味感
        1.1.4 D-氨基酸的用途
    1.2 D-氨基�；�
        1.2.1 D-氨基酰化酶的概念
        1.2.2 D-氨基�；傅姆诸�
        1.2.3 D-氨基�；傅膽�
        1.2.4 來源于M.natoriense中的D-氨基�；�
    1.3 分子伴侶
        1.3.1 分子伴侶的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 分子伴侶的分類和分布
        1.3.3 分子伴侶的作用
        1.3.4 分子伴侶的應用前景
        1.3.5 熱休克蛋白60(HSP60)
        1.3.6 在超嗜熱古細菌Thermococcus kodakarensis中的分子伴侶
    1.4 本文研究的目的及研究內(nèi)容
        1.4.1 研究目的
        1.4.2 研究內(nèi)容
第2章 恢復菌種
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 主要試劑和試劑盒
        2.1.3 實驗菌株
        2.1.4 溶液及培養(yǎng)基配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 JM109-pUC19-DAA菌種的恢復與鑒定
        2.2.2 M.TNJL143-2菌種的恢復與鑒定
        2.2.3 DE3-pET21a-CpkA菌種的恢復與鑒定
        2.2.4 DE3-pACYCDuet1-CpkA菌種的恢復與鑒定
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 JM109-pUC19-DAA菌種的鑒定結(jié)果
        2.3.2 M.TNJL143-2菌種的鑒定結(jié)果
        2.3.3 DE3-pET21a-CpkA菌種的鑒定結(jié)果
        2.3.4 DE3-pACYCDuet1-CpkA菌種的鑒定結(jié)果
    2.4 本章小結(jié)
第3章 定點突變重組質(zhì)粒JM109-pUC19-DAA
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑和試劑盒
        3.1.3 實驗菌株
        3.1.4 溶液及培養(yǎng)基配置
    3.2 實驗方法
        3.2.1 JM109-pUC19-DAA質(zhì)粒的提取
        3.2.2 定點突變JM109-pUC19-DAA質(zhì)粒
        3.2.3 鑒定PCR產(chǎn)物
        3.2.4 突變菌的轉(zhuǎn)化
        3.2.5 突變菌種的培養(yǎng)、提取與鑒定
        3.2.6 突變質(zhì)粒雙酶切反應
        3.2.7 PCR DAA片段(1488 bp)鑒定各突變質(zhì)粒
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 定點突變后PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果
        3.3.2 突變質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        3.3.3 突變質(zhì)粒雙酶切反應的鑒定結(jié)果
        3.3.4 PCR DAA片段(1488 bp)的鑒定結(jié)果
        3.3.5 突變質(zhì)粒JM109-pUC19-DAA測序結(jié)果
    3.4 本章小結(jié)
第4章 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的構(gòu)建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 實驗菌株
        4.1.4 培養(yǎng)基及溶液
    4.2 實驗方法
        4.2.1 目的基因DAA的獲取
        4.2.2 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA的提取
        4.2.3 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA雙酶切
        4.2.4 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA去磷酸化
        4.2.5 目的基因與重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA連接
        4.2.6 構(gòu)建攜帶重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA重組菌
        4.2.7 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的提取與鑒定
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果
        4.3.2 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA的鑒定結(jié)果
        4.3.3 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA雙酶切反應的鑒定結(jié)果
        4.3.4 重組質(zhì)粒DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA測序結(jié)果
    4.4 本章小結(jié)
第5章 酶的表達與活性鑒定
    5.1 實驗材料
        5.1.1 主要儀器
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 實驗菌株
        5.1.4 培養(yǎng)基及溶液
    5.2 實驗方法
        5.2.1 菌種培養(yǎng)及粗酶液的獲取
        5.2.2 酶的表達鑒定
        5.2.3 標準曲線的制作
        5.2.4 鑒定酶的活性
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 酶表達的鑒定結(jié)果
        5.3.2 活性的鑒定結(jié)果
        5.3.3 活性對比的結(jié)果
        5.3.4 重組菌中DAA活性結(jié)果
    5.4 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
附錄A 重組載體R103A測序結(jié)果
附錄B 重組載體R103K測序結(jié)果
附錄C 重組載體V125K測序結(jié)果
附錄D 重組載體V125L測序結(jié)果
附錄E 重組載體A196K測序結(jié)果
附錄F 重組載體V296L測序結(jié)果
附錄G 重組載體V296K測序結(jié)果
附錄H 重組載體DE3-pACYCDuet1-CpkA-DAA測序結(jié)果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]人類味覺與氨基酸味道[J]. 蔣瀅,徐穎,朱庚伯.  氨基酸和生物資源. 2002(04)
[4]左旋對羥基苯甘氨酸的技術(shù)進展[J]. 王京平,智瑞彩.  河北化工. 1999(04)
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本文編號：3707414