Kex2蛋白酶是一種來源于酵母的前體加工蛋白酶,能識別并切割堿性氨基酸殘基對中的羧基端肽鍵,在酵母的蛋白分泌途徑中起關(guān)鍵作用,并且在真核細胞蛋白的研究中也應(yīng)用廣泛。目前多用畢赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）來表達Kex2蛋白酶,但有關(guān)畢赤酵母Kex2蛋白酶（PPKex2）的同源活性表達與酶學(xué)性質(zhì)的研究還鮮有報道,并且Kex2蛋白酶較低的表達量導(dǎo)致其生產(chǎn)成本過高,不利于大規(guī)模的應(yīng)用。本課題利用畢赤酵母表達系統(tǒng)對PPKex2進行了同源表達,并研究其酶學(xué)性質(zhì),同時與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）Kex2蛋白酶（SCKex2）進行了比較。并采用高密度擴大發(fā)酵、截短C端序列、更換啟動子和伴侶蛋白共表達等方式提高PPKex2的表達量。主要研究成果如下所述:（1）分別從畢赤酵母和釀酒酵母基因組中獲得kex2基因,將其插入到表達載體pPIC9K中,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株。重組菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后,結(jié)果表明PPKex2的蛋白濃度達到0.42 mg·mL^-1,酶活達到30.2 U·L^... 

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 立題意義
    1.2 國內(nèi)外研究進展
        1.2.1 Kex2 蛋白酶簡介
        1.2.2 Kex2 蛋白酶的應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.3 畢赤酵母表達系統(tǒng)概述
        1.2.4 實現(xiàn)畢赤酵母高效表達的策略
        1.2.5 畢赤酵母啟動子研究應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.6 畢赤酵母伴侶蛋白共表達研究應(yīng)用現(xiàn)狀
        1.2.7 畢赤酵母發(fā)酵優(yōu)化策略
    1.3 主要研究思路和研究內(nèi)容
        1.3.1 主要研究思路
        1.3.2 主要研究內(nèi)容
        1.3.3 課題來源
第二章 材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基與溶液
        2.1.3 主要試劑與儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 P.pastoris GS115 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.2 PPKex2和SCKex2 表達質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.3 PPKex2的C端截短表達質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.4 啟動子改造質(zhì)粒及工程菌的構(gòu)建
        2.2.5 共表達伴侶蛋白質(zhì)粒及表達菌株的構(gòu)建
        2.2.6 表達菌株的生長及目的蛋白的表達
        2.2.7 Kex2 蛋白酶酶活力測定方法
        2.2.8 Kex2 蛋白酶的純化與鑒定
        2.2.9 Kex2 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)的研究
        2.2.10 重組菌株3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵和發(fā)酵優(yōu)化
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 PPKex2和SCKex2 的表達與純化
        3.1.1 畢赤酵母中PPKex2和SCKex2 的表達
        3.1.2 PPKex2和SCKex2 的分離純化與鑒定
    3.2 PPKex2和SCKex2 的酶學(xué)性質(zhì)比較
        3.2.1 最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度的研究
        3.2.2 pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性的研究
        3.2.3 動力學(xué)參數(shù)的測定
    3.3 PPKex2 重組菌株的高密度發(fā)酵優(yōu)化
        3.3.1 PPKex2的3 L發(fā)酵罐高密度擴大發(fā)酵
        3.3.2 添加輔助表達物對PPKex2 表達的影響
    3.4 PPKex2的C端截短(SPPKex2)以提高表達量的研究
        3.4.1 SPPKex2的C端截短序列的確定
        3.4.2 SPPKex2 在畢赤酵母中的表達
    3.5 啟動子改造對PPKex2 表達量的影響
        3.5.1 啟動子改造菌株的構(gòu)建與表達
        3.5.2 雙啟動子共表達菌株的構(gòu)建與表達
    3.6 伴侶蛋白共表達對PPKex2 表達量的影響
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 ：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]畢赤酵母高效表達外源蛋白的相關(guān)策略及研究進展[J]. 朱文,胡又佳,謝麗萍.  中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 2018(04)
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[4]巴斯德畢赤酵母啟動子研究進展[J]. 薛亞慧,樓覺人.  國際生物制品學(xué)雜志. 2016 (02)
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[6]雙碳源流加對重組畢赤酵母高效表達葡萄糖氧化酶的影響[J]. 沈伊娜,顧磊,張娟,陳堅,堵國成.  生物工程學(xué)報. 2013(07)
[7]共表達伴侶蛋白對重組畢赤酵母產(chǎn)米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶發(fā)酵過程的影響[J]. 盧鑫,喻曉蔚,沙沖,范文來,徐巖.  微生物學(xué)通報. 2013(03)
[8]同時利用AOX1和GAP啟動子表達SAM合成酶促進重組畢赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸積累[J]. 呂中原,錢江潮,儲炬,郭美錦,王永紅,莊英萍,張嗣良.  工業(yè)微生物. 2008(04)

碩士論文
[1]酸性脂肪酶的高效表達、酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用研究[D]. 張曉鳳.江南大學(xué) 2018
[2]米曲霉脯氨酰內(nèi)肽酶在畢赤酵母中的表達、酶學(xué)特性及其應(yīng)用研究[D]. 江婷.江南大學(xué) 2016
[3]分子伴侶與信號肽對分泌蛋白在巴斯德畢赤酵母中表達水平的影響研究[D]. 杜濟良.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2011



本文編號：3705934