乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是符合GRAS標準的革蘭氏陽性菌,由于其生長快速、新陳代謝簡單、遺傳背景清晰等特點,在食品工業(yè)、臨床醫(yī)藥等領域受到了極高的關注度。L.lactis的表達系統(tǒng)有很多種,其中,以Nisin誘導的NICE表達系統(tǒng)應用最為廣泛。借助NICE表達系統(tǒng),越來越多的異源食品酶實現(xiàn)了在L.lactis中的發(fā)酵生產。γ-谷氨酰轉移酶（GGT）由于其催化谷胱甘肽或其衍生物的水解/將γ-谷氨酰基轉移至各種受體的能力而被廣泛應用于食品工業(yè)和制藥領域。為了提高GGT的產量并簡化其純化的過程,本實驗將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens BH072）來源的ggt基因和Usp45信號肽基因融合并構建了GGT在L.lactis中分泌表達的重組菌株。又由于游離酶在生物催化中的不穩(wěn)定性及不可重復使用性,我們通過共價結合的方法將L.lactis中表達的異源GGT酶和MTG酶固定在磁性納米粒子上,得到了高酶活性、高穩(wěn)定性和可重復使用的固定化酶。最后,在最佳固定條件下對固定化酶的性質進行探究。主要實驗結果如下:（1）提取B.amyloliquef... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 乳酸乳球菌概述
        1.1.1 乳酸乳球菌簡介
        1.1.2 乳酸乳球菌的表達系統(tǒng)
    1.2 γ-谷氨酰轉移酶
        1.2.1 γ-谷氨酰轉移酶的來源及分布
        1.2.2 γ-谷氨酰轉移酶的結構
        1.2.3 γ-谷氨酰轉移酶的催化性質
        1.2.4 γ-谷氨酰轉移酶的應用
    1.3 谷氨酰胺轉氨酶
        1.3.1 微生物來源的谷氨酰胺轉氨酶
        1.3.2 谷氨酰胺轉氨酶的結構
        1.3.3 谷氨酰胺轉氨酶的催化機制
        1.3.4 谷氨酰胺轉氨酶的應用
    1.4 固定化酶概述
        1.4.1 固定化酶的應用
        1.4.2 制備固定化酶的方法
    1.5 磁性納米材料
    1.6 課題的研究目的意義及研究內容
        1.6.1 課題研究目的及意義
        1.6.2 主要研究內容
第二章 谷氨酰轉移酶在乳酸乳球菌中的分泌表達
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株及質粒
        2.1.2 材料與試劑
        2.1.3 實驗試劑的配制
        2.1.4 所用PCR引物及引物的特征
        2.1.5 主要的實驗儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 L.lactis感受態(tài)細胞的制備
        2.2.2 GGT進化分析和同源性比對
        2.2.3 誘導型重組表達載體p NZ8048-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)的構建
        2.2.4 組成型重組表達載體p NZ8048-P_(p5)-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)-6his的構建
        2.2.5 重組SP_(usp45)-GGT-6His的誘導型表達、純化及表達條件的優(yōu)化
        2.2.6 重組SP_(usp45)-GGT-6His的組成型表達及純化
        2.2.7 兩種重組表達菌株與原始菌株生長曲線的比較
        2.2.8 蛋白質的純化
        2.2.9 GGT-6His的酶學性質測定
        2.2.10 GGT-6His催化合成L-茶氨酸及其鑒定
    2.3 數據處理
    2.4 結果與分析
        2.4.1 GGT進化分析及同源性比對
        2.4.2 誘導型重組表達系統(tǒng)的構建
        2.4.3 組成型重組表達系統(tǒng)的構建
        2.4.4 蛋白質表達及表達條件的優(yōu)化
        2.4.5 生長曲線
        2.4.6 酶學性質的測定
        2.4.7 L-茶氨酸的合成及檢測
    2.5 本章小結
第三章 磁性氧化鐵納米材料的制備及固定化酶的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料與試劑
        3.1.2 實驗試劑的配制
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 多孔磁性Fe_3O_4納米粒子的制備
        3.2.2 磁性納米材料的表征
        3.2.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.4 BaGGT@Fe_3O_4MNPs和游離BaGGT的穩(wěn)定性比較
        3.2.5 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.6 MTG@Fe_3O_4MNPs和游離MTG的穩(wěn)定性比較
    3.3 數據處理
    3.4 結果與分析
        3.4.1 多孔磁性納米粒子的制備
        3.4.2 磁性納米材料的表征
        3.4.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.4.4 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
    3.5 本章小結
第四章 殼聚糖-磁性納米粒子的制備及固定化酶的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料與試劑
        4.1.2 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 殼聚糖-四氧化三鐵納米粒子的制備
        4.2.2 磁性納米材料的表征
        4.2.3 對CS-Fe_3O_4MNPs表面基團的修飾
        4.2.4 BaGGT-6His在3-APTES/CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
        4.2.5 BaGGT@CS-Fe_3O_4MNPs和游離BaGGT的穩(wěn)定性比較
    4.3 數據處理
    4.4 結果與分析
        4.4.1 復合磁性納米材料的制備
        4.4.2 磁性納米材料的表征
        4.4.3 BaGGT-6His在 CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
    4.5 本章小結
第五章 結論與展望
    5.1 結論
    5.2 本文創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間的學術活動及成果情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]功能化磁性納米材料在磷酸化肽富集中的應用[J]. 熊芳芳,江丹丹,賈瓊.  色譜. 2020(01)



本文編號：3677993