乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是符合GRAS標(biāo)準(zhǔn)的革蘭氏陽性菌,由于其生長(zhǎng)快速、新陳代謝簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰等特點(diǎn),在食品工業(yè)、臨床醫(yī)藥等領(lǐng)域受到了極高的關(guān)注度。L.lactis的表達(dá)系統(tǒng)有很多種,其中,以Nisin誘導(dǎo)的NICE表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。借助NICE表達(dá)系統(tǒng),越來越多的異源食品酶實(shí)現(xiàn)了在L.lactis中的發(fā)酵生產(chǎn)。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）由于其催化谷胱甘肽或其衍生物的水解/將γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移至各種受體的能力而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和制藥領(lǐng)域。為了提高GGT的產(chǎn)量并簡(jiǎn)化其純化的過程,本實(shí)驗(yàn)將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens BH072）來源的ggt基因和Usp45信號(hào)肽基因融合并構(gòu)建了GGT在L.lactis中分泌表達(dá)的重組菌株。又由于游離酶在生物催化中的不穩(wěn)定性及不可重復(fù)使用性,我們通過共價(jià)結(jié)合的方法將L.lactis中表達(dá)的異源GGT酶和MTG酶固定在磁性納米粒子上,得到了高酶活性、高穩(wěn)定性和可重復(fù)使用的固定化酶。最后,在最佳固定條件下對(duì)固定化酶的性質(zhì)進(jìn)行探究。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:（1）提取B.amyloliquef... 

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 乳酸乳球菌概述
        1.1.1 乳酸乳球菌簡(jiǎn)介
        1.1.2 乳酸乳球菌的表達(dá)系統(tǒng)
    1.2 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶
        1.2.1 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的來源及分布
        1.2.2 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的催化性質(zhì)
        1.2.4 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用
    1.3 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶
        1.3.1 微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶
        1.3.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)
        1.3.3 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的催化機(jī)制
        1.3.4 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用
    1.4 固定化酶概述
        1.4.1 固定化酶的應(yīng)用
        1.4.2 制備固定化酶的方法
    1.5 磁性納米材料
    1.6 課題的研究目的意義及研究?jī)?nèi)容
        1.6.1 課題研究目的及意義
        1.6.2 主要研究?jī)?nèi)容
第二章 谷氨酰轉(zhuǎn)移酶在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 材料與試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        2.1.4 所用PCR引物及引物的特征
        2.1.5 主要的實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 L.lactis感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 GGT進(jìn)化分析和同源性比對(duì)
        2.2.3 誘導(dǎo)型重組表達(dá)載體p NZ8048-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)的構(gòu)建
        2.2.4 組成型重組表達(dá)載體p NZ8048-P_(p5)-sp_(usp45)-ggt_(Δsp)-6his的構(gòu)建
        2.2.5 重組SP_(usp45)-GGT-6His的誘導(dǎo)型表達(dá)、純化及表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.2.6 重組SP_(usp45)-GGT-6His的組成型表達(dá)及純化
        2.2.7 兩種重組表達(dá)菌株與原始菌株生長(zhǎng)曲線的比較
        2.2.8 蛋白質(zhì)的純化
        2.2.9 GGT-6His的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
        2.2.10 GGT-6His催化合成L-茶氨酸及其鑒定
    2.3 數(shù)據(jù)處理
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 GGT進(jìn)化分析及同源性比對(duì)
        2.4.2 誘導(dǎo)型重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
        2.4.3 組成型重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
        2.4.4 蛋白質(zhì)表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.4.5 生長(zhǎng)曲線
        2.4.6 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定
        2.4.7 L-茶氨酸的合成及檢測(cè)
    2.5 本章小結(jié)
第三章 磁性氧化鐵納米材料的制備及固定化酶的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料與試劑
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 多孔磁性Fe_3O_4納米粒子的制備
        3.2.2 磁性納米材料的表征
        3.2.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.4 BaGGT@Fe_3O_4MNPs和游離BaGGT的穩(wěn)定性比較
        3.2.5 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.2.6 MTG@Fe_3O_4MNPs和游離MTG的穩(wěn)定性比較
    3.3 數(shù)據(jù)處理
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 多孔磁性納米粒子的制備
        3.4.2 磁性納米材料的表征
        3.4.3 BaGGT-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
        3.4.4 MTG-6His在 Fe_3O_4MNPs上的固定化
    3.5 本章小結(jié)
第四章 殼聚糖-磁性納米粒子的制備及固定化酶的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料與試劑
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 殼聚糖-四氧化三鐵納米粒子的制備
        4.2.2 磁性納米材料的表征
        4.2.3 對(duì)CS-Fe_3O_4MNPs表面基團(tuán)的修飾
        4.2.4 BaGGT-6His在3-APTES/CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
        4.2.5 BaGGT@CS-Fe_3O_4MNPs和游離BaGGT的穩(wěn)定性比較
    4.3 數(shù)據(jù)處理
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 復(fù)合磁性納米材料的制備
        4.4.2 磁性納米材料的表征
        4.4.3 BaGGT-6His在 CS-Fe_3O_4MNPs上的固定化
    4.5 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 本文創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]功能化磁性納米材料在磷酸化肽富集中的應(yīng)用[J]. 熊芳芳,江丹丹,賈瓊.  色譜. 2020(01)



本文編號(hào)：3677993