發(fā)布時間：2022-08-23 14:56

　　隨著Nav1.7成為治療疼痛而無副作用的新靶點,開發(fā)出該鈉離子通道特異性的鎮(zhèn)痛藥成為許多制藥企業(yè)的研究熱點。小鼠基因組與人類基因組具有較高的同源性,因此,小鼠一直是人類疾病治療藥物臨床前研究階段主要的動物模型之一。但由于人源和鼠源蛋白之間存在種屬差異,會使試驗結(jié)果之間產(chǎn)生數(shù)據(jù)偏差,導致許多藥物在進入臨床研究階段后,面臨很高的失敗風險。人SCN9A基因編碼Nav1.7的功能性亞基,研發(fā)以Nav1.7為靶標的鎮(zhèn)痛藥物,亟需SCN9A人源化小鼠的構(gòu)建。人SCN9A基因約180 kb,人類基因組細菌人工染色體（BAC）文庫中沒有單一的BAC將其完全涵蓋,具有完整基因BAC載體的縫合成為SCN9A人源化小鼠構(gòu)建的前提。本文利用DNA同源重組工程進行人SCN9A基因的縫合,獲得了一個308 kb的BAC,同時將Sleeping Beauty（SB）轉(zhuǎn)座酶識別的反向重復序列（IRs）添加至這個BAC載體的兩側(cè),使得該超大BAC轉(zhuǎn)基因載體在進行轉(zhuǎn)座時,不會轉(zhuǎn)座BAC載體的序列。在進行BAC修飾時,將Venus熒光蛋白與人SCN9A蛋白用2A自剪切多肽序列相連,作為報告基因,可以示蹤人SCN9A蛋白在小... 

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
縮略語表
第一章 緒論
    1.1 DNA同源重組工程
        1.1.1 DNA同源重組工程簡介
        1.1.2 DNA同源重組工程原理
        1.1.3 DNA同源重組工程的應用
    1.2 SCN9A與Na_v1.7
        1.2.1 SCN9A與Na_v1.7簡介
        1.2.2 SCN9A與神經(jīng)性疼痛病
        1.2.3 以Na_v1.7為靶點的鎮(zhèn)痛藥物的研究與開發(fā)
    1.3 人工核酸內(nèi)切酶介導的基因編輯技術(shù)
        1.3.1 鋅指核酸酶(ZFNs)
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)
        1.3.3 由RNA指導的Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)
    1.4 立題依據(jù)和意義
    1.5 技術(shù)路線
第二章 人SCN9A基因的BAC縫合
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基、抗生素和誘導劑
        2.1.3 重組引物及測序引物
        2.1.4 化學試劑
        2.1.5 儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒的小量提取與大量提取
        2.2.2 酶切鑒定
        2.2.3 聚合酶鏈式反應
        2.2.4 DNA的苯酚/氯仿/異戊醇抽提與酒精沉淀
        2.2.5 大腸桿菌的電轉(zhuǎn)方法
        2.2.6 在GB05-dir中進行線性DNA之間的重組
        2.2.7 在GB08-red中進行線性DNA和環(huán)形DNA之間的重組
    2.3 實驗過程及結(jié)果分析
        2.3.1 BACAlRP11-746P5的修飾
        2.3.2 G856D和A1632E點突變
        2.3.3 BAC b1 CH17-291A18的修飾
        2.3.4 BAC縫合
        2.3.5 BAC縫合后修飾
    2.4 討論
第三章 SCN9A人源化小鼠胚胎干細胞的構(gòu)建
    3.1 實驗材料
        3.1.1 細胞系和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基和抗生素
        3.1.3 檢測引物
        3.1.4 化學試劑
        3.1.5 儀器設(shè)備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
        3.2.2 單克隆的挑取
        3.2.3 細胞基因組DNA96孔板提取方法
    3.3 實驗過程及結(jié)果分析
    3.4 討論
第四章 Scn9a基因敲除小鼠胚胎干細胞的構(gòu)建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 質(zhì)粒
        4.1.2 重組引物及測序引物
    4.2 實驗方法
        4.2.1 小鼠胚胎干細胞基因打靶的核轉(zhuǎn)染方法
        4.2.2 細胞基因組DNA 24孔板提取方法
        4.2.3 ExoCET技術(shù)
    4.3 實驗過程及結(jié)果分析
        4.3.1 gRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 基因打靶載體的構(gòu)建
        4.3.3 基因打靶及基因型分析
    4.4 討論
第五章 全文總結(jié)與展望
附圖一: 本文所構(gòu)質(zhì)粒預期的酶切鑒定圖譜
附表一: 本文所構(gòu)質(zhì)粒預期的酶切條帶大小
參考文獻
致謝
碩士研究生期間發(fā)表的學術(shù)論文
學位論文評閱及答辯情況表


【參考文獻】：
博士論文
[1]microRNA-7敲除小鼠模型的建立及雄性生殖力分析[D]. 林皓.中國農(nóng)業(yè)大學 2019
[2]應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生產(chǎn)NRAMP1基因精準插入的轉(zhuǎn)基因牛[D]. 高元鵬.西北農(nóng)林科技大學 2017
[3]DNA直接克隆的優(yōu)化和ccdB反向篩選在Red/ET重組工程中的應用[D]. 王海龍.湖南師范大學 2013

碩士論文
[1]PiggyBac介導CYP3A4轉(zhuǎn)基因肝細胞系的長期穩(wěn)定表達研究及其藥物肝毒性評價[D]. 鄒淑香.華南理工大學 2016
[2]基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因打靶研究[D]. 劉倩男.河南大學 2015



本文編號：3677972