雙果糖酐Ⅲ（difructo se anhydride,DFA Ⅲ）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型天然功能性甜味劑,具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、促進(jìn)骨骼生長、改善便秘等功能,而且甜度較高但能量較低,并具有良好的理化性質(zhì),適用于烘焙、飲料、醫(yī)藥制劑中。但是DFA Ⅲ在自然界中含量較低,利用提取分離的手段獲得產(chǎn)品的成本較高;而通過利用化學(xué)法制備DFA Ⅲ也存在產(chǎn)物中同分異構(gòu)體較多,分離純化困難,并且污染環(huán)境等問題。因此,該產(chǎn)品目前主要是采用生物法制備:利用菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶（IFTase）催化菊糖分解生成DFA Ⅲ。該方法轉(zhuǎn)化率高,安全可靠,并且菊糖來源廣泛,適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),是近年來研究的熱點。但是現(xiàn)有的IFTase普遍存在酶活性不高,轉(zhuǎn)化率低,生產(chǎn)成本高等問題,因此利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段獲得新的IFTase,提高催化效率,降低轉(zhuǎn)化成本對于推動DFA Ⅲ的廣泛應(yīng)用十分重要。本研究首先通過生物信息分析,對IFTase的氨基酸序列進(jìn)行對比,通過分子克隆和表達(dá),獲得來源于克雷伯氏菌的目的基因編碼的酶Kp-IFTase。經(jīng)初步鑒定,該酶具有催化菊糖分解生成雙果糖苷Ⅲ及其它果寡糖的功能。該酶具有良好的耐熱性并... 

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 新型功能性甜味劑雙果糖酐Ⅲ
        1.1.1 雙果糖酐Ⅲ的功能性質(zhì)
        1.1.2 雙果糖酐Ⅲ合成策略
    1.2 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的研究概述
        1.2.2 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)
        1.2.3 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)機理
    1.3 構(gòu)建高效質(zhì)粒載體
        1.3.1 分子克隆的策略
        1.3.2 消除非重組背景
    1.4 宏基因組學(xué)簡介
        1.4.1 宏基因組學(xué)研究策略
        1.4.2 基因組DNA的提取
    1.5 酶固定化方法的研究概述
        1.5.1 交聯(lián)酶聚集體技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用
        1.5.2 凝結(jié)多糖的性質(zhì)及凝膠材料的應(yīng)用
        1.5.3 仿生硅技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.5.4 介孔材料的研究進(jìn)展
    1.6 研究的目的和意義
第二章 一種克雷伯氏菌的IFTase的分子克隆及酶學(xué)性質(zhì)的研究
    2.1 試驗材料與儀器
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 主要儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 擴增與Aa-IFTase氨基酸序列同源性較高的基因片段及其克隆
        2.2.2 對pANY2-Kp-IFTase質(zhì)粒的定點突變
        2.2.3 Kp-IFTase的表達(dá)與催化產(chǎn)物的鑒定
        2.2.4 Kp-IFTase酶學(xué)性質(zhì)的研究
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 擴增與Aa-IFTase氨基酸序列同源性較高的基因片段及其克隆
        2.3.2 對pANY2-Kp-IFTase質(zhì)粒的定點突變及酶活鑒定
        2.3.3 Kp-IFTase的表達(dá)與催化產(chǎn)物的鑒定
        2.3.4 Kp-IFTase酶學(xué)性質(zhì)的研究
    2.4 結(jié)論
第三章 一種用于多種克隆策略的表達(dá)載體的構(gòu)建,功能驗證及Aa-IFTase基因的克隆
    3.1 試驗材料與儀器
        3.1.1 試驗材料
    3.2 試驗方法
        3.2.1 質(zhì)粒載體pANY1 的構(gòu)建
        3.2.2 pANY1 用于Aa-IFTase基因進(jìn)行粘性末端克隆的功能驗證
        3.2.3 pANY1 用于平末端克隆的功能驗證
        3.2.4 pANY1 用于TA克隆的功能驗證
        3.2.5 pANY1 用于重組酶克隆的功能驗證
        3.2.6 pANY1 用于一種基于PCR產(chǎn)物退火反應(yīng)的克隆策略
        3.2.7 pANY1 用于蛋白表達(dá)和蛋白純化的功能驗證
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 質(zhì)粒載體pANY1 的構(gòu)建
        3.3.2 pANY1 用于Aa-IFTase基因進(jìn)行粘性末端克隆的功能驗證
        3.3.3 pANY1 用于平末端克隆的功能驗證
        3.3.4 pANY1 用于TA克隆的功能驗證
        3.3.5 pANY1 用于重組酶克隆的功能驗證
        3.3.6 pANY1 用于一種基于PCR產(chǎn)物退火反應(yīng)的克隆策略
        3.3.7 pANY1 用于蛋白表達(dá)和蛋白純化的功能驗證
    3.4 結(jié)論
第四章 利用宏基因組區(qū)段改組法對Aa-IFTase進(jìn)行分子改造
    4.1 試驗材料與儀器
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 主要儀器
    4.2 試驗方法
        4.2.1 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶(Aa-IFTase)基因的克隆與表達(dá)
        4.2.2 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶(Aa-IFTase)催化菊糖反應(yīng)產(chǎn)物鑒定
        4.2.3 提取土壤微生物基因組DNA并采用高通量16s rDNA測序檢測
        4.2.4 分析基于石英砂提取土壤微生物基因組DNA方法的偏好性
        4.2.5 利用基于石英砂的方法提取多種生物的基因組DNA
        4.2.6 土壤樣品微生物群落多樣性分析
        4.2.7 基于石英砂的方法提取五份不同土壤微生物的基因組DNA
        4.2.8 基于土壤微生物多樣性設(shè)計簡并引物
        4.2.9 構(gòu)建宏基因組區(qū)段改組庫
        4.2.10 重組子的篩選與IFTase酶活的鑒定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶(Aa-IFTase)基因的克隆與表達(dá)
        4.3.2 菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶(Aa-IFTase)催化菊糖反應(yīng)產(chǎn)物鑒定
        4.3.3 提取土壤微生物基因組DNA并采用高通量16s rDNA測序檢測
        4.3.4 分析基于石英砂提取土壤微生物基因組DNA方法的偏好性
        4.3.5 利用基于石英砂的方法提取多種生物的基因組DNA
        4.3.6 土壤樣品微生物群落多樣性分析
        4.3.7 基于石英砂的方法提取五份不同土壤微生物總DNA
        4.3.8 基于土壤微生物多樣性設(shè)計簡并引物
        4.3.9 構(gòu)建宏基因組區(qū)段改組庫
        4.3.10 重組子的篩選與IFTase酶活的鑒定
    4.4 結(jié)論
第五章 基于凝結(jié)多糖制備介孔CLEAs-仿生硅復(fù)合微球包埋菊糖果糖基轉(zhuǎn)移酶
    5.1 試驗材料與儀器
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 主要儀器
    5.2 試驗方法
        5.2.1 基于凝結(jié)多糖的介孔CLEAs-仿生硅復(fù)合微球的制備及包埋條件的優(yōu)化
        5.2.2 復(fù)合微球的表征
        5.2.3 各種因素對游離酶和固定化酶活力的影響
        5.2.4 游離酶和固定化酶的穩(wěn)定性
        5.2.5 固定化酶的重復(fù)使用性能
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 基于凝結(jié)多糖的介孔CLEAs-仿生硅復(fù)合微球的制備及包埋條件的優(yōu)化
        5.3.2 固定化復(fù)合微球的表征
        5.3.3 各種因素對游離酶和固定化酶活力的影響
        5.3.4 游離酶和固定化酶的穩(wěn)定性
        5.3.5 固定化酶的重復(fù)使用性能
    5.4 結(jié)論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]凝膠多糖的研究及其應(yīng)用[J]. 趙振剛,陳山,盧家炯.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2004(06)
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[7]功能性食品基料——菊粉的研究進(jìn)展[J]. 饒志娟,鄭建仙,賈呈祥.  中國甜菜糖業(yè). 2002(04)
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本文編號：3663130