生物固氮是高耗能的過程,每還原1分子N2消耗16分子ATP,因此,固氮基因的表達(dá)受到胞內(nèi)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,能量合成是影響固氮基因表達(dá)的重要因素。中心碳代謝是生物體所需能量的主要來源,α-酮戊二酸是胞內(nèi)碳狀態(tài)的信號(hào)分子。研究表明,微生物中氮代謝調(diào)控蛋白GlnK可通過與α-酮戊二酸結(jié)合從而感知體內(nèi)碳信號(hào)并調(diào)控氮代謝基因的表達(dá),通過直接分子對話介導(dǎo)碳氮代謝偶聯(lián)調(diào)控。此外,研究發(fā)現(xiàn)某些固氮菌中,固氮特異調(diào)節(jié)蛋白NifA也具有感知并結(jié)合α-酮戊二酸的能力,表明固氮基因的表達(dá)可直接響應(yīng)胞內(nèi)碳信號(hào)水平。施氏假單胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）是一株水稻根際聯(lián)合固氮菌,該菌在低氮、微好氧條件具有固氮能力,該菌的固氮基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究比較深入,但氮代謝調(diào)控系統(tǒng)對碳信號(hào)的感應(yīng)傳遞模式及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本研究分析了 A1501菌中氮代謝調(diào)控蛋白GlnK和NifA的蛋白序列特征,并通過同源建模、位點(diǎn)突變、蛋白表達(dá)及蛋白-小分子互作等方法,測定了 A1501菌中GlnK和NifA蛋白與α-酮戊二酸的分子互作,比較了 NifA蛋白與突變蛋白對固氮基因表達(dá)的影響,研究結(jié)果為深入解... 

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要符號(hào)對照表
第一章 緒論
    1.1 生物固氮
        1.1.1 生物固氮概述
        1.1.2 影響生物固氮活性的環(huán)境因素
    1.2 固氮基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制
        1.2.1 棕色固氮菌固氮基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與機(jī)制
        1.2.2 肺炎克雷伯固氮基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與機(jī)制
        1.2.3 施氏假單胞菌A1501固氮基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與機(jī)制
    1.3 固氮調(diào)控蛋白GlnK與NifA的研究進(jìn)展
        1.3.1 一般氮代謝調(diào)控PII蛋白的研究進(jìn)展
        1.3.2 固氮特異正調(diào)控蛋白NifA的研究進(jìn)展
    1.4 立題依據(jù)與技術(shù)路線
        1.4.1 立題依據(jù)
        1.4.2 技術(shù)路線
第二章 GlnK蛋白與α-酮戊二酸的體外互作
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液
        2.1.3 主要酶類和試劑盒
        2.1.4 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細(xì)菌基因組的提取
        2.2.2 PCR擴(kuò)增
        2.2.3 蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.4 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.5 微量熱泳動(dòng)(Microscale Thermophoresis,MST)實(shí)驗(yàn)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 GlnK生物信息學(xué)分析
        2.3.2 GlnK及其點(diǎn)突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.3 GlnK及其點(diǎn)突變蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.3.4 GlnK及其點(diǎn)突變蛋白與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸的互作
        2.3.5 GlnK與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸互作的空間結(jié)構(gòu)模擬
    2.4 討論
第三章 NifA蛋白與α-酮戊二酸的體外結(jié)合
    3.1 材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 培養(yǎng)基及緩沖液
        3.1.3 主要酶和試劑盒
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PCR擴(kuò)增
        3.2.2 提取低拷貝質(zhì)粒pLAFR3
        3.2.3 三親結(jié)合
        3.2.4 固氮酶活測定
        3.2.5 菌株RNA的提取
        3.2.6 反轉(zhuǎn)錄
        3.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)
        3.2.8 Western Blot
        3.2.9 生長曲線測定
        3.2.10 過氧化氫沖擊
        3.2.11 鹽沖擊
        3.2.12 山梨醇沖擊
        3.2.13 Swimming實(shí)驗(yàn)
        3.2.14 生物膜測定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 NifA蛋白生物信息學(xué)分析
        3.3.2 NifA及NifA-F119S蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.3 NifA及NifA-F119S蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        3.3.4 NifA及NifA-F119S蛋白與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸的互作
        3.3.5 NifA與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸互作的空間結(jié)構(gòu)模擬
        3.3.6 野生型nifA基因及突變nifA基因回補(bǔ)nifA突變株的回補(bǔ)株構(gòu)建
        3.3.7 與nifA突變株相關(guān)菌株固氮酶活測定
        3.3.8 固氮條件下野生型及nifA突變株和功能回補(bǔ)株中nifA和nifH基因的表達(dá)
        3.3.9 Western Blot檢測不同菌株NifH蛋白表達(dá)量
        3.3.10 nifA基因全局調(diào)控功能的鑒定
    3.4 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號(hào)：3657290