人感染高致病性 H7N9 禽流感（Highly pathogenic avian influenza H7N9,HPAIH7N9）病毒病例首次出現(xiàn)于2016年底的H7N9第五波疫情中,之后于2019年春再次出現(xiàn)。作為2013年出現(xiàn)的新型H7N9病毒的變異體,HPAI H7N9病毒的主要特征是其血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白裂解位點上出現(xiàn)多堿性氨基酸的插入,從而使H7N9病毒由低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza,LPAI）病毒轉變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲胁《�。雖然人感染HPAI H7N9病例的死亡率與LPAI H7N9（“低致病”指對禽類而言）相似,但似乎前者的病情發(fā)展更快、臨床癥狀更嚴重。截止到2020年4年27日,HPAIH7N9病毒已造成33例實驗室確診病例,其中16例死亡。神經(jīng)氨酸酶抑制劑（Neuraminidase inhibitors,NAIs）類藥物是臨床治療H7N9禽流感病例的主要手段,但由于流感病毒易突變的特點,需對病毒的耐藥性進行實時監(jiān)測。本研究首次系統(tǒng)全面地對人感染HPAI H7N9病毒病例分離株進行NAIs耐藥性研... 

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【學位級別】：博士

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英文縮略詞表
摘要
ABSTRACT
一.前言
    1.人感染高致病性H7N9禽流感病毒
    2.神經(jīng)氨酸酶抑制劑及耐藥位點
二.材料與方法
    1.病毒
        1.1 野生型HPAI H7N9病毒
        1.2 HPAI H7N9重組病毒的制備
        1.3 H7N9/PR8重組病毒的制備
    2.細胞
        2.1 MDCK細胞的培養(yǎng)
        2.2 293T細胞的培養(yǎng)
    3.病毒測序及分析
        3.1 Sanger測序
        3.2 二代測序
        3.3 突變位點混合氨基酸比例分析
    4.流感病毒NA活性及其活性抑制的測定方法
    5.潛在NAIs耐藥突變位點的篩選
    6.病毒滴定(TCID_(50))及生長曲線
        6.1 病毒滴定
        6.2 生長曲線
    7.NAIs誘導HPAI H7N9病毒氨基酸突變
    8.HA、NA蛋白上氨基酸突變位點標記及展示
    9.小鼠實驗
        9.1 麻醉及感染
        9.2 解剖及取材
        9.3 小鼠灌胃給藥
        9.4 組織研磨及病毒載量測定
        9.5 血凝試驗和血凝抑制試驗
        9.6 病理學實驗
    10.統(tǒng)計學分析
    11.生物安全
    12.主要試劑耗材及實驗儀器設備
三.結果
    第一部分 HPAI H7N9病毒藥物敏感性及耐藥位點的鑒定
        1.HPAI H7N9野毒株耐藥表型鑒定
        2.HPAI H7N9野毒株潛在耐藥突變位點的篩選
        3.重組HPAI H7N9病毒制備成功
        4.HPAI H7N9病毒耐藥位點的鑒定
        5.HPAI H7N9耐藥株在哺乳動物細胞上的生長情況
        6.NA耐藥位點在N9晶體結構中的展示
        7.HA上多堿性氨基酸對HPAIH7N9耐藥株復制的影響
    第二部分 HPAIH7N9重組病毒在NAIs作用下出現(xiàn)適應性突變
        1.內部基因未出現(xiàn)氨基酸突變
        2.NA蛋白上出現(xiàn)R292K、E119V/G氨基酸突變
        3.HA蛋白上出現(xiàn)多個氨基酸突變
        4.HA蛋白的氨基酸突變聚集在HA1區(qū)域
    第三部分 N9 1222L- E119V雙位點突變的協(xié)同耐藥作用
        1.HPAI H7N9病毒NAI222L突變對E119V位點有協(xié)同耐藥作用(體外)
        2.NA222L-119V雙位點突變HPAIH7N9病毒在MDCK細胞上復制良好
        3.H7N9/PR8重組病毒制備成功
        4.rg006NA/PR8、rg006NA119V/PR8、rg006NA222L-119V/PR8病毒對小鼠的致病性
            4.1 體重減輕及致死率
            4.2 在小鼠呼吸道中復制水平
            4.3 對小鼠的感染能力
            4.4 肺炎情況及抗原分布
        5.rg006NA/PR8、 rg006NA119V/PR8、 rg006NA222L-119V/PR8病毒在小鼠上的耐藥性
            5.1 體重損失及死亡率
            5.2 肺病毒載量
            5.3 肺炎情況及抗原分布
四.討論
五.結論
六.參考文獻
七.綜述 Research Progress on Human Infection with Avian Influenza H7N9 Virus
    參考文獻
八.致謝
九.博士生期間科研成果
十.個人簡歷



本文編號：3649074